ssDNA/RNA环化连接酶

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Seebio	ECE1187A-2000U	2000U	有	1,286 元	- +
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中文名	ssDNA/RNA环化连接酶

基本信息

名称：ssDNA/RNA 环化连接酶，也称为 CircLigase。

来源：通常是通过基因工程技术在特定的宿主细胞中表达生产得到的重组酶。

规格：常见的有 2000U、20KU 等不同规格。

酶的特性

热稳定性：为热稳定的 DNA/RNA 连接酶，能在较高温度下保持活性。

作用方式：不依赖于 ATP，可催化单链 DNA 或单链 RNA 的分子内环化。但泽叶生物的产品可催化分子间连接，对单链 DNA 的连接效率更高。

底物要求：要求催化底物单链 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基团和 3’-OH 基团。对于大于 15nt 的单链底物，能高效连接。

活性定义：65°C 1h 条件下，催化 1pmol 5’- 磷酸化的 ssDNA 底物环化，所需的酶量定义为 1Unit

反应条件

反应液配制：通常包含 CircLigase、5’磷酸化 ssDNA/RNA、10×CircLigase Buffer 以及适量的 ddH₂O。上海抚生实业的产品还提到有时需加入 50mM MnCl₂。

反应温度和时间：一般为 65°C 孵育 1h 进行环化反应。

终止反应：反应结束后，可加入终浓度 10mM EDTA 终止反应，也可采用加热方式 85℃ 10min 加热失活。

使用注意事项

环化底物 ssDNA 或 RNA 必须带有 5’磷酸基团，3’端含有 OH。

环化体系中的 ATP 浓度高于 20μM 以上时会极大抑制环化效率，甚至导致环化失败，建议底物为纯化产物。

由于酶具有耐热性，在 65℃条件下进行连接反应，测试中 Betain 无益于连接效率提升（泽叶生物的产品对于含有二级或复杂结构的连接底物，可加入 0.4 - 0.8M Betain 以提高连接效率）。

该酶主要进行分子内环化连接（泽叶生物的产品可催化分子间连接），分子间的连接通常未检测到。

酶对 ssDNA 和 RNA 的环化效率高，多数情况下，90% 以上的底物被环化。未被环化的 ssDNA 可通过加入 5U 的 Exonuclease I，37°C 消化 15min 去除，以获得高纯度的环化 ssDNA。

酶可以连接 15nt 以上的核苷酸，更长的产物连接参数可能需要进一步测试。

在小体系实验时注意体系的蒸发，可加入矿物油以防止蒸发。