Seebio®硫酸软骨素（Chondroitin sulfate CS）AC定量检测试剂盒（酶法）

【检测原理和用途】

硫酸软骨素（Chondroitin sulfate, CS）是一种糖胺聚糖，根据二糖单元硫酸化位点的不同可细分为CS-A、CS-B、CS-C、CS-D、CS-E、CS-F等十一种类型。牛、猪、鸡等软骨来源的CS以CS-A为主；鲨鱼以CS-C为主；鱼类、鲨鱼和鱿鱼可得到CS-D；鱿鱼以CS-E为主。CS在角膜修复、免疫调节、保护软骨、调节肿瘤生长、促进生物矿化和抗病毒等方面展现出生物活性，已被广泛应用于生物粘合剂、药物递送系统、细胞支架和表面涂层等，具有良好的生物相容性、可设计性等优势。本试剂盒利用硫酸软骨素AC的特异性降解酶，将CS分解为不饱和糖醛酸，并在232nm波长处产生特异性光吸收，通过标准曲线法可实现对样本中CS含量的精确测定。

【使用说明】

一、工前准备

1.设备准备

请事先准备好酶标仪、移液器、无菌离心管、温箱等。

2.标准品工作液制备

取一支标准品，准确加入1000µL稀释液，混合均匀后形成1000 µg/ml的CS溶液，随后通过倍比稀释方法，制备获得1000µg/ml、500µg/ml、250µg/ml、125µg/ml、62.5µg/ml、31.3µg/ml、15.6µg/ml、7.8µg/ml的标准品溶液，各500µl。

3.酶工作液制备

取酶，加入600µl稀释液，轻轻混匀，室温溶解10min，形成10×母液。将之分装6支，100µl/支，-20℃可稳定保存6个月。

使用时，将10×母液用稀释液稀释10倍（即每支加入900ul稀释液），形成酶工作液。

4.样品制备

用稀释液溶解或稀释样品，必要时可通过离心和/或0.22µm过滤处理后获得上清用于后续检测，避免有不溶性物质存在。调整样品中的CS浓度至7~1000g/mL范围内。

二、 检测步骤

1.预热

将稀释液和配制好的底物液于37℃保温5min。酶标仪开机预热30min，调节检测波长至232 nm。

2.标准曲线绘制

（1）标记好标准品的孔位，每个标准品孔设置2重复，在标准品孔内加入酶工作液，50μl/孔。

（2）分别取各浓度的标准品工作液，加入对应标记好的UV酶标板孔内，200μl/孔。

（3）立即读取OD₂₃₂数值，记为OD_T0值。

（4）于37℃恒温孵育30min。

（5）读取第30min时的OD₂₃₂数值，记为OD_T1值。

（6）以标准品浓度为x轴，对应∆OD（OD_T1-OD_T0）值为y轴，绘制标准曲线，R²≥0.9900。

3.样品测定

（1）UV酶标板上标记好样品孔和溶剂对照孔。

（2）在样品孔和对照孔内加入酶工作液，50μl/孔。

（3）分别取200μl样品和溶剂，加入样品孔和溶剂对照孔内，200 μl/孔。

（4）立即读取OD232数值，记为ODT0值。

（5）于37℃恒温孵育30min。

（6）读取第30min时的OD232数值，记为ODT1值。

（7）计算∆OD（ODT1-ODT0）值，根据标准曲线和样品稀释倍数计算样品中硫酸软骨素AC的含量。

三、结果计算

Xi=d*(∆OD-b)/a

式中：

Xi —— 样品中的CS浓度（μg/ml）；

d—— 样品稀释倍数；

∆OD—— 0min和30min的OD232差值；

a —— 标准方程式中的斜率a；

b —— 标准方程式中的截距b。