Seebio®硫酸皮肤素（Dermatan sulfate）定量检测试剂盒（酶法）

【包装规格】

【检测原理和用途】

硫酸皮肤素（Dermatan sulfate，DS）属于糖胺聚糖类，亦称作硫酸软骨素B，其结构由β-艾杜糖醛酸-(1-3)-N-乙酰基-β-半乳糖胺-4硫酸的重复二糖单元构成。DS分子具有显著的负电荷特性，易于与蛋白质发生共价键结合，形成蛋白聚糖。在生物体内，DS广泛存在于细胞外基质和血管壁中，发挥着细胞黏附、信号传导、抗凝血以及血管保护等生理功能和药理作用。硫酸皮肤素已被应用于治疗骨关节炎和心血管疾病。在化妆品领域，DS被用于保湿、抗衰老以及改善皮肤健康。此外，DS在饮食补充剂中亦有应用。本试剂盒利用硫酸皮肤素的特异性降解酶，将DS分解为不饱和糖醛酸，并在232nm波长处产生特异性光吸收，通过标准曲线法可实现对样本中DS含量的精确测定。

【使用说明】

一、工前准备

1.设备准备

请事先准备好酶标仪、移液器、无菌离心管、温箱等。

2.标准品工作液制备

取一支标准品，准确加入1000µL稀释液，混合均匀后形成500µg/ml的DS溶液，随后通过倍比稀释方法，制备获得250µg/ml、125µg/ml、62.5µg/ml、31.3µg/ml、15.6µg/ml、7.8µg/ml的标准品溶液，各500µl。

3.酶工作液制备

取酶，加入500µl稀释液，轻轻混匀，室温溶解10min，形成4×母液。-20℃可稳定保存6个月。

使用时，将4×母液用稀释液稀释4倍，形成酶工作液。

4.样品制备

用稀释液溶解或稀释样品，必要时可通过离心和/或0.22µm过滤处理后获得上清用于后续检测，避免有不溶性物质存在。调整样品中的DS浓度至7~250 µg/mL范围内。

二、检测步骤

1.预热

将稀释液和配制好的底物液于37℃保温5min。酶标仪开机预热30min，调节检测波长至232 nm。

2.标准曲线绘制

（1）标记好标准品的孔位，每个标准品孔设置2重复，在标准品孔内加入酶工作液，50μl/孔。

（2）分别取各浓度的标准品工作液，加入对应标记好的UV酶标板孔内，200μl/孔。

（3）立即读取OD₂₃₂数值，记为OD_T0值。

（4）于37℃恒温孵育30min。

（5）读取第30min时的OD₂₃₂数值，记为OD_T1值。

以标准品浓度为x轴，对应∆OD（OD_T1-OD_T0）值为y轴，绘制标准曲线，R²≥0.9900。

3.样品测定

（1）UV酶标板上标记好样品孔和溶剂对照孔。

（2）在样品孔和对照孔内加入酶工作液，50μl/孔。

（3）分别取200μl样品和溶剂，加入样品孔和溶剂对照孔内，200 μl/孔。

（4）立即读取OD232数值，记为ODT0值。

（5）于37℃恒温孵育30min。

（6）读取第30min时的OD232数值，记为ODT1值。

（7）计算∆OD（ODT1-ODT0）值，根据标准曲线和样品稀释倍数计算样品中硫酸皮肤素的含量。

三、结果计算

Xi=d*(∆OD-b)/a

式中：

Xi —— 样品中的DS浓度（μg/ml）；

d—— 样品稀释倍数；

∆OD——0min和30min的OD232差值；

a —— 标准方程式中的斜率a；

b —— 标准方程式中的截距b。