1.项目背景
摘自《总甲状腺素检测试剂注册技术审查指导原则》
1.1甲状腺素（T4）的介绍
甲状腺素（T4），即3,5,3',5'-四碘甲腺原氨酸，分子量约为776.93道尔顿，是甲状腺腺体分泌的主要激素，以游离形式释放进入血循环中，绝大多数（99%以上）与血浆中的蛋白质结合，称为结合态，还有极微量的T4未与血浆中的蛋白质结合，称为游离态。
虽然结合型的甲状腺激素在血液中占了绝大多数，但真正发挥生理作用的仍然是游离的甲状腺激素。它的主要功能有维持生长发育、促进代谢、产生神经系统及心血管效应、影响长骨的生长和脑的发育，是下丘脑-垂体-甲状腺激素调节系统的组成部分，具有调节机体代谢的作用。
总甲状腺素（TT4）指血清中游离态与结合态甲状腺素总和，TT4的检测在临床上作为甲状腺功能异常的辅助诊断，不作为甲状腺癌的辅助诊断。
1.2 临床意义
1.2.1 TT4增高的临床意义
TT4升高见于：①甲状腺功能亢进（包括原发性、继发性甲亢以及自主功能结节、T4型甲亢）时，甲状腺合成和分泌TT4增高；②新生儿一时性甲状腺功能亢进；③亚急性甲状腺炎和无痛性甲状腺炎（如慢性淋巴细胞性甲状腺炎）；④大量服用甲状腺素和动物甲状腺；⑤口服避孕药、雌激素、肝炎、遗传性TBG增高、吸毒等均能使TT4增高；⑥TSH不适当分泌综合征时增高。
1.2.2 TT4降低的临床意义
TT4降低见于：①甲状腺功能减低时，TT4减低；②甲状腺缺乏，或先天性发育不良，甲状腺全切除后，血TT4缺乏；③各种非甲状腺疾病，如各种肝病、肝硬化、肝昏迷、肾病、肾衰、心肌梗死、呼吸及消化系统的严重疾病、传染病、创伤、烧伤、饥饿、蛋白营养不良、糖尿病等，均可导致低T3综合征，病情严重者TT4亦降低。若TT4显著降低，提示病情危重预后不良。病情缓解后TT4恢复正常。
FT4 是一种未结合的具有生物活性的形式，在总T4中仅占0.03%。绝大部分T4无活性，与血清蛋白结合，如甲状腺结合球蛋白(75%)，前白蛋白(15%)，白蛋白(10%)。游离T4的检测理论上不受结合蛋白浓度和结合力特性的影响，因此不需要额外进行反映结合参数类项目的检测(如T-uptake，TBG)。
因此游离甲状腺素的测定是临床常规诊断的重要指标。当怀疑甲状腺功能紊乱时，常常
联合检测游离T4和TSH。FT4也适合于甲状腺抑制治疗的疗效监测多种方法可测定游离甲状腺素水平。平衡透析法和超滤法直接测定fT3和fT4是标化常规免疫检测方法的参考测量程序，免疫程序一般用于常规诊断。
1.3小分子双抗体夹心法
2024年公开专利CN117871874A《小分子物质免疫检测方法》对小分子夹心法的反应原理做了详细阐述，摘抄部分内容如下。
本发明提出了一种小分子物质免疫检测方法，其特征在于，包括：（1）将含有小分子物质的样本、配体、第二抗体和表面活性剂进行反应，得到小分子物质-配体-第二抗体三元复合物，且所述小分子物质-配体-第二抗体三元复合物中小分子物质诱导配体形成至少一个新的构象表位，所述第二抗体可特异性结合所述至少一个新的构象表位，所述表面活性剂可消除所述第二抗体与构象未改变的配体之间的结合；（2）检测所述小分子物质-配体-第二抗体三元复合物。
样本中的小分子物质与配体发生特异性结合，得到小分子物质-配体复合物，并且小分子物质-配体复合物中小分子物质诱导配体形成至少一个新的构象表位。小分子物质-配体复合物与第二抗体和表面活性剂反应，第二抗体特异性地与形成新构象表位的配体结合，同时也会与构象未改变的配体产生弱结合。表面活性剂可消除第二抗体与构象未改变的配体之间的结合，得到小分子物质-配体-第二抗体三元复合物。通过检测三元复合物，可以实现小分子物质检测。由此，采用双抗体夹心法可以提高检测准确性和灵敏度，不同浓度梯度样本检测区分度高。同时，减少了筛选高特异性复合物抗体的难度，更有利于小分子物质检测试剂盒的大规模生产和检测，应用价值高。
2. 性能表现
针对TT4/FT4的检测（夹心法），西宝生物推出2株抗体、1株抗原及1种解离剂。
具体性能如下（以下评估仅代表在西宝生物的工艺体系下的验证，建议客户根据自身工艺进行更为详细的验证）。
2.1化学发光（AE）平台
组合1（TT4）：T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记吖啶酯+总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用）（货号：DCH0209A）；
线性范围：0.5ug/dL-25ug/dL；最低检出限：0.5ug/dL。
组合1（FT4）：T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记吖啶酯；
线性范围：0.1ng/dL-7ng/dL；最低检出限：0.1ng/dL。
2.2化学发光（AP）平台
组合2（TT4）：T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4（货号：EKY0325G）标记碱性磷酸酶+总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用）（货号：DCH0209A）；
线性范围：0.5ug/dL-25ug/dL；最低检出限：0.5ug/dL。
组合2（FT4）：T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记碱性磷酸酶；
线性范围：0.1ng/dL-7ng/dL；最低检出限：0.1ng/dL。
2.3稳定性评估
2.3.1 各组分工作液稳定性
采用Seebio品牌甲状腺素（T4）结合物AE发光稀释液（货号：DCD0525A）分别将磁珠包被T4抗体浓缩液、吖啶酯标记T4抗体浓缩液配置成工作液及Seebio品牌甲状腺素（T4）AP酶标记物稀释液（货号DCD0526A）将碱性磷酸酶标记T4抗体浓缩液配置成工作液，分别进行37℃热稳定性实验。如表1所示：
a.磁珠包被T4抗体工作液单独37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±10%以内（不含S0），表明磁珠包被T4抗体工作液热稳定性良好；
b.吖啶酯标记T4抗体工作液单独37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±10%以内（不含S0），表明吖啶酯标记T4抗体工作液热稳定性较好；
c.碱性磷酸酶标记T4抗体工作液单独37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±20%以内（不含S0），表明碱性磷酸酶标记T4抗体工作液热稳定性较好。
表1 T4各组分工作液热稳定性7天数据
序号 | T4标准品稀释浓度 μg/dL | 磁珠-包被T4抗体工作液37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值均值差异 | 吖啶酯标记T4抗体工作液37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值均值差异 | 碱性磷酸酶标记T4抗体工作液37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值均值差异 |
S0 | 0 | 0.4% | -3.6% | -1.6% |
S1 | 0.5 | -3.7% | -4.3% | -19.4% |
S2 | 5 | -0.8% | -0.1% | -16.4% |
S3 | 10 | 2.1% | -0.9% | -15.9% |
S4 | 20 | 5.5% | -3.2% | -15.4% |
S5 | 40 | 6.5% | -4.9% | -12.1% |
平均变化（不含S0） | 1.9% | -2.7% | -15.8% | |
2.3.2 T4标准品稳定性
2.3.2.1 采用甲状腺素（T4）标准品稀释液1（货号：DCD0527A）含复合酶保护剂AFP（ACE0074A）或复合酶稳定剂AES（ACE0070A）分别将T4标准品（货号：DKY0346A）稀释成5个梯度（液体型），进行37℃热稳定性实验。
a）T4标准品稀释梯度（液体型）2-8℃热加速7天与-20℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;
b）T4标准品稀释梯度（液体型）37℃热加速7天与-20℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;
c）T4标准品抗原稀释梯度（液体型）37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;表明T4标准品在稀释梯度（液体型）稳定性良好。
表2 T4标准品梯度（液体型）稳定性数据-T4标准品稀释液1
序号 | T4标准品梯度μg/dL | T4标准品梯度（液体型）2-8℃ 7天与-20℃ 7天差异 | T4标准品梯度（液体型）37℃ 7天与-20℃ 7天差异 | T4标准品梯度（液体型）37℃ 7天与2℃-8℃ 7天差异 |
S0 | 0 | 4.5% | 5.7% | 3.4% |
S1 | 0.5 | -3.9% | -1.6% | 2.3% |
S2 | 5 | 9.7% | 5.2% | -4.1% |
S3 | 10 | -3.7% | 0.6% | 4.4% |
S4 | 20 | 3.1% | 8.6% | 5.3% |
S5 | 40 | 0.2% | 3.5% | 3.3% |
平均变化（不含S0） | 1.1% | 3.3% | 2.3% | |
2.3.2.2 采用甲状腺素（T4）标准品稀释液2（货号：DCD0527B）含复合酶保护剂AFP（ACE0074A）或蛋白保护剂AEP-HBC（ACL0012A）或复合酶稳定剂AES（ACE0070A）分别将T4标准品（货号：DKY0346A）稀释成5个梯度（液体型），进行37℃热稳定性实验。
d）T4标准品稀释梯度（液体型）2-8℃热加速7天与-20℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;
e）T4标准品稀释梯度（液体型）37℃热加速7天与-20℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;
f）T4标准品抗原稀释梯度（液体型）37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;表明T4标准品在稀释梯度（液体型）稳定性良好。
表3 T4标准品梯度（液体型）稳定性数据-T4标准品稀释液2
序号 | T4标准品梯度μg/dL | T4标准品梯度（液体型） 2-8℃ 7天与-20℃ 7天差异 | T4标准品梯度（液体型）37℃ 7天与 -20℃ 7天差异 | T4标准品梯度（液体型）37℃ 7天与 2℃-8℃ 7天差异 |
S0 | 0 | 4.5% | -4.9% | -9.0% |
S1 | 0.5 | -5.3% | -4.4% | -4.2% |
S2 | 5 | -1.5% | -0.6% | 1.0% |
S3 | 10 | 0.4% | -5.5% | -6.1% |
S4 | 20 | -0.7% | -5.4% | -4.7% |
S5 | 40 | -0.8% | -6.0% | -5.3% |
平均变化（不含S0） | -1.6% | -4.4% | -3.9% | |
2.3.3 酶解深水鱼皮明胶与牛血清白蛋白临床数据对比
a.采用酶解深水鱼皮明胶（货号：ACH0085J）配成发光稀释液，用发光稀释液分别将磁珠包被T4抗体浓缩液、吖啶酯标记T4抗体浓缩液配置成工作液；
b.采用牛血清白蛋白（货号：DCL0001T）配成发光稀释液，用发光稀释液分别将磁珠包被T4抗体浓缩液、吖啶酯标记T4抗体浓缩液配置成工作液；
c.用a和b配成的工作液，分别测试TT4不同浓度的临床样本。如表4所示，两种缓冲体系下临床相关系数r均大于0.975，结果相当。含酶解深水鱼皮明胶缓冲体系测试的信噪比更优。因此，在T4项目上，酶解深水鱼皮明胶（货号：ACH0085J）可替代牛血清白蛋白（货号：DCL0001T）。
表4 酶解深水鱼皮明胶与牛血清白蛋白临床数据对比数据
序号 | TT4罗氏样本 浓度值 ug/dL | 含酶解深水鱼皮明胶 缓冲体系 | 含牛血清白蛋白 缓冲体系 |
发光值 | 发光值 | ||
1 | 1.43 | 48821 | 83958 |
4 | 1.85 | 77098 | 118731 |
8 | 2.40 | 148503 | 139248 |
9 | 3.40 | 221520 | 242465 |
12 | 4.37 | 398014 | 393013 |
15 | 5.83 | 594089 | 528993 |
18 | 6.96 | 775815 | 694465 |
22 | 7.57 | 766796 | 706264 |
26 | 8.52 | 987549 | 893024 |
30 | 9.76 | 1236330 | 1021238 |
32 | 10.10 | 1225415 | 1076131 |
33 | 11.50 | 1352271 | 1125118 |
37 | 14.60 | 1693892 | 1400102 |
40 | 15.60 | 1673493 | 1363475 |
43 | 16.90 | 1633366 | 1359156 |
44 | 17.40 | 1853622 | 1404460 |
45 | 18.50 | 1842468 | 1617591 |
50 | 20.80 | 2615908 | 2183121 |
51 | 22.90 | 2607963 | 2247072 |
临床相关性r | / | 0.987 | 0.984 |
信噪比 | 16.01 | 53.42 | 26.76 |
3.临床相关性
3.1化学发光（AE）平台：
3.1.1 西宝生物发光（AE）平台TT4抗体配对组合1与罗氏诊断的TT4试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2＞0.95，相关性较好；
3.1.2西宝生物发光（AE）平台FT4抗体配对组合1与罗氏诊断的FT4试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2＞0.95，相关性良好。
3.2化学发光（AP）平台：
3.2.1西宝生物发光（AP）平台TT4抗体配对组合2与罗氏诊断的TT4试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2＞0.95左右，相关性较好；
3.2.2西宝生物发光（AP）平台FT4抗体配对组合2与罗氏诊断的FT4试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2在0.94左右，相关性良好。
4. 测试方案
4.1化学发光（AE）平台
4.1.1 TT4抗体配对组合1
样本:样品加样量10ul；
试剂1：T4抗体（货号：EKY0325F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：T4抗体（货号：EKY0325G）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；
试剂3：总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用）（货号：DCH0209A）。
反应条件：
第一步：10ul预稀释样本+50ul试剂1+50ul 试剂2+50ul试剂3，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入预激发液及激发液，进行测试。
4.1.2 FT4抗体配对组合1
样本:样品加样量10ul；
试剂1：T4抗体（货号：EKY0325F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：T4抗体（货号：EKY0325G）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；
反应条件：
第一步：10ul预稀释样本+50ul试剂1+50ul 试剂2，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入预激发液及激发液，进行测试。
测试使用发光仪器:科斯迈SMART 500S。
4.2化学发光（AP）平台
4.2.1 TT4抗体配对组合2：
样本:样品加样量10ul；
试剂1：T4抗体（货号：EKY0325F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：T4抗体（货号：EKY0325G）标记-碱性磷酸酶稀释物，用量50ul/测试；
试剂3：总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用）（货号：DCH0209A）。
反应条件：
第一步：10ul预稀释样本+50ul试剂1+50ul 试剂2+50ul试剂3，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，进行测试。
4.2.2 FT4抗体配对组合2：
样本:样品加样量10ul；
试剂1：T4抗体（货号：EKY0325F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：T4抗体（货号：EKY0325G）标记-碱性磷酸酶稀释物，用量50ul/测试；
反应条件：
第一步：10ul预稀释样本+50ul试剂1+50ul试剂2混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，进行测试。
测试使用发光仪器:迎凯Shine i2900。
5.产品信息
产品名称 | 货号 | 推荐配对 |
甲状腺素（T4）抗体 | EKY0325F | TT4配对： T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记吖啶酯+TT4解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）（发光配对组合1） T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4单抗（货号：EKY0325G）标记碱性磷酸酶+TT3/TT4解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）（发光配对组合2） |
甲状腺素（T4）抗体 | EKY0325G | |
甲状腺素（T4）抗体 | EKY0325F | FT4配对： T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记吖啶酯（发光配对组合1） T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记碱性磷酸酶（发光配对组合2） |
甲状腺素（T4）抗体 | EKY0325G | |
甲状腺素（T4），标准品 | DKY0346A | |
T4抗体（货号：）包被羧基磁珠浓缩液 | DKY1341A | |
T4抗体（货号：）吖啶酯浓缩液 | DKY1342A | |
T4抗体（货号：）标记碱性磷酸酶浓缩液 | DKY1342B | |
AMPPD 发光底物液（即用型） | DCD0517A | |
AMPPD 发光底物液（即用型） | DCD0517B | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用） | DCH0209A | 同DCH0208A一样 |
酶解深水鱼皮明胶 | ACH0085J | 磁珠及标记物抗体稀释液。建议使用浓度1%-10%。 |
牛血清白蛋白(无蛋白酶,低脂肪酸,低lgG,内毒素) | DCL0001T-100g | 磁珠浓缩液、吖啶酯浓缩液、碱性磷酸酶浓缩液的稀释液中及包被及标记种封闭剂含有此款BSA可有效降低背景信号值及提高信噪比。建议使用浓度1%-2%。 |
DCL0001T-1Kg | ||
甲状腺素（T4）AE发光稀释液 | DCD0525A | |
甲状腺素（T4）AP酶标记物稀释液 | DCD0526A | |
甲状腺素（T4）标准品稀释液1 | DCD0527A | |
甲状腺素（T4）标准品稀释液2 | DCD0527B | |
复合酶保护剂AFP | ACE0074A | 建议使用浓度5%左右。 |
蛋白保护剂AEP-HBC | ACL0012A | 建议使用浓度5%左右。 |
复合酶稳定剂AES | ACE0070A | 建议使用浓度不高于4%。 |
1.项目背景
摘自《总甲状腺素检测试剂注册技术审查指导原则》
1.1甲状腺素（T4）的介绍
甲状腺素（T4），即3,5,3',5'-四碘甲腺原氨酸，分子量约为776.93道尔顿，是甲状腺腺体分泌的主要激素，以游离形式释放进入血循环中，绝大多数（99%以上）与血浆中的蛋白质结合，称为结合态，还有极微量的T4未与血浆中的蛋白质结合，称为游离态。
虽然结合型的甲状腺激素在血液中占了绝大多数，但真正发挥生理作用的仍然是游离的甲状腺激素。它的主要功能有维持生长发育、促进代谢、产生神经系统及心血管效应、影响长骨的生长和脑的发育，是下丘脑-垂体-甲状腺激素调节系统的组成部分，具有调节机体代谢的作用。
总甲状腺素（TT4）指血清中游离态与结合态甲状腺素总和，TT4的检测在临床上作为甲状腺功能异常的辅助诊断，不作为甲状腺癌的辅助诊断。
1.2 临床意义
1.2.1 TT4增高的临床意义
TT4升高见于：①甲状腺功能亢进（包括原发性、继发性甲亢以及自主功能结节、T4型甲亢）时，甲状腺合成和分泌TT4增高；②新生儿一时性甲状腺功能亢进；③亚急性甲状腺炎和无痛性甲状腺炎（如慢性淋巴细胞性甲状腺炎）；④大量服用甲状腺素和动物甲状腺；⑤口服避孕药、雌激素、肝炎、遗传性TBG增高、吸毒等均能使TT4增高；⑥TSH不适当分泌综合征时增高。
1.2.2 TT4降低的临床意义
TT4降低见于：①甲状腺功能减低时，TT4减低；②甲状腺缺乏，或先天性发育不良，甲状腺全切除后，血TT4缺乏；③各种非甲状腺疾病，如各种肝病、肝硬化、肝昏迷、肾病、肾衰、心肌梗死、呼吸及消化系统的严重疾病、传染病、创伤、烧伤、饥饿、蛋白营养不良、糖尿病等，均可导致低T3综合征，病情严重者TT4亦降低。若TT4显著降低，提示病情危重预后不良。病情缓解后TT4恢复正常。
FT4 是一种未结合的具有生物活性的形式，在总T4中仅占0.03%。绝大部分T4无活性，与血清蛋白结合，如甲状腺结合球蛋白(75%)，前白蛋白(15%)，白蛋白(10%)。游离T4的检测理论上不受结合蛋白浓度和结合力特性的影响，因此不需要额外进行反映结合参数类项目的检测(如T-uptake，TBG)。
因此游离甲状腺素的测定是临床常规诊断的重要指标。当怀疑甲状腺功能紊乱时，常常
联合检测游离T4和TSH。FT4也适合于甲状腺抑制治疗的疗效监测多种方法可测定游离甲状腺素水平。平衡透析法和超滤法直接测定fT3和fT4是标化常规免疫检测方法的参考测量程序，免疫程序一般用于常规诊断。
1.3小分子双抗体夹心法
2024年公开专利CN117871874A《小分子物质免疫检测方法》对小分子夹心法的反应原理做了详细阐述，摘抄部分内容如下。
本发明提出了一种小分子物质免疫检测方法，其特征在于，包括：（1）将含有小分子物质的样本、配体、第二抗体和表面活性剂进行反应，得到小分子物质-配体-第二抗体三元复合物，且所述小分子物质-配体-第二抗体三元复合物中小分子物质诱导配体形成至少一个新的构象表位，所述第二抗体可特异性结合所述至少一个新的构象表位，所述表面活性剂可消除所述第二抗体与构象未改变的配体之间的结合；（2）检测所述小分子物质-配体-第二抗体三元复合物。
样本中的小分子物质与配体发生特异性结合，得到小分子物质-配体复合物，并且小分子物质-配体复合物中小分子物质诱导配体形成至少一个新的构象表位。小分子物质-配体复合物与第二抗体和表面活性剂反应，第二抗体特异性地与形成新构象表位的配体结合，同时也会与构象未改变的配体产生弱结合。表面活性剂可消除第二抗体与构象未改变的配体之间的结合，得到小分子物质-配体-第二抗体三元复合物。通过检测三元复合物，可以实现小分子物质检测。由此，采用双抗体夹心法可以提高检测准确性和灵敏度，不同浓度梯度样本检测区分度高。同时，减少了筛选高特异性复合物抗体的难度，更有利于小分子物质检测试剂盒的大规模生产和检测，应用价值高。
2. 性能表现
针对TT4/FT4的检测（夹心法），西宝生物推出2株抗体、1株抗原及1种解离剂。
具体性能如下（以下评估仅代表在西宝生物的工艺体系下的验证，建议客户根据自身工艺进行更为详细的验证）。
2.1化学发光（AE）平台
组合1（TT4）：T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记吖啶酯+总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用）（货号：DCH0209A）；
线性范围：0.5ug/dL-25ug/dL；最低检出限：0.5ug/dL。
组合1（FT4）：T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记吖啶酯；
线性范围：0.1ng/dL-7ng/dL；最低检出限：0.1ng/dL。
2.2化学发光（AP）平台
组合2（TT4）：T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4（货号：EKY0325G）标记碱性磷酸酶+总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用）（货号：DCH0209A）；
线性范围：0.5ug/dL-25ug/dL；最低检出限：0.5ug/dL。
组合2（FT4）：T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记碱性磷酸酶；
线性范围：0.1ng/dL-7ng/dL；最低检出限：0.1ng/dL。
2.3稳定性评估
2.3.1 各组分工作液稳定性
采用Seebio品牌甲状腺素（T4）结合物AE发光稀释液（货号：DCD0525A）分别将磁珠包被T4抗体浓缩液、吖啶酯标记T4抗体浓缩液配置成工作液及Seebio品牌甲状腺素（T4）AP酶标记物稀释液（货号DCD0526A）将碱性磷酸酶标记T4抗体浓缩液配置成工作液，分别进行37℃热稳定性实验。如表1所示：
a.磁珠包被T4抗体工作液单独37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±10%以内（不含S0），表明磁珠包被T4抗体工作液热稳定性良好；
b.吖啶酯标记T4抗体工作液单独37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±10%以内（不含S0），表明吖啶酯标记T4抗体工作液热稳定性较好；
c.碱性磷酸酶标记T4抗体工作液单独37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±20%以内（不含S0），表明碱性磷酸酶标记T4抗体工作液热稳定性较好。
表1 T4各组分工作液热稳定性7天数据
序号 | T4标准品稀释浓度 μg/dL | 磁珠-包被T4抗体工作液37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值均值差异 | 吖啶酯标记T4抗体工作液37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值均值差异 | 碱性磷酸酶标记T4抗体工作液37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值均值差异 |
S0 | 0 | 0.4% | -3.6% | -1.6% |
S1 | 0.5 | -3.7% | -4.3% | -19.4% |
S2 | 5 | -0.8% | -0.1% | -16.4% |
S3 | 10 | 2.1% | -0.9% | -15.9% |
S4 | 20 | 5.5% | -3.2% | -15.4% |
S5 | 40 | 6.5% | -4.9% | -12.1% |
平均变化（不含S0） | 1.9% | -2.7% | -15.8% | |
2.3.2 T4标准品稳定性
2.3.2.1 采用甲状腺素（T4）标准品稀释液1（货号：DCD0527A）含复合酶保护剂AFP（ACE0074A）或复合酶稳定剂AES（ACE0070A）分别将T4标准品（货号：DKY0346A）稀释成5个梯度（液体型），进行37℃热稳定性实验。
a）T4标准品稀释梯度（液体型）2-8℃热加速7天与-20℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;
b）T4标准品稀释梯度（液体型）37℃热加速7天与-20℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;
c）T4标准品抗原稀释梯度（液体型）37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;表明T4标准品在稀释梯度（液体型）稳定性良好。
表2 T4标准品梯度（液体型）稳定性数据-T4标准品稀释液1
序号 | T4标准品梯度μg/dL | T4标准品梯度（液体型）2-8℃ 7天与-20℃ 7天差异 | T4标准品梯度（液体型）37℃ 7天与-20℃ 7天差异 | T4标准品梯度（液体型）37℃ 7天与2℃-8℃ 7天差异 |
S0 | 0 | 4.5% | 5.7% | 3.4% |
S1 | 0.5 | -3.9% | -1.6% | 2.3% |
S2 | 5 | 9.7% | 5.2% | -4.1% |
S3 | 10 | -3.7% | 0.6% | 4.4% |
S4 | 20 | 3.1% | 8.6% | 5.3% |
S5 | 40 | 0.2% | 3.5% | 3.3% |
平均变化（不含S0） | 1.1% | 3.3% | 2.3% | |
2.3.2.2 采用甲状腺素（T4）标准品稀释液2（货号：DCD0527B）含复合酶保护剂AFP（ACE0074A）或蛋白保护剂AEP-HBC（ACL0012A）或复合酶稳定剂AES（ACE0070A）分别将T4标准品（货号：DKY0346A）稀释成5个梯度（液体型），进行37℃热稳定性实验。
d）T4标准品稀释梯度（液体型）2-8℃热加速7天与-20℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;
e）T4标准品稀释梯度（液体型）37℃热加速7天与-20℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;
f）T4标准品抗原稀释梯度（液体型）37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均变化在±10%以内;表明T4标准品在稀释梯度（液体型）稳定性良好。
表3 T4标准品梯度（液体型）稳定性数据-T4标准品稀释液2
序号 | T4标准品梯度μg/dL | T4标准品梯度（液体型） 2-8℃ 7天与-20℃ 7天差异 | T4标准品梯度（液体型）37℃ 7天与 -20℃ 7天差异 | T4标准品梯度（液体型）37℃ 7天与 2℃-8℃ 7天差异 |
S0 | 0 | 4.5% | -4.9% | -9.0% |
S1 | 0.5 | -5.3% | -4.4% | -4.2% |
S2 | 5 | -1.5% | -0.6% | 1.0% |
S3 | 10 | 0.4% | -5.5% | -6.1% |
S4 | 20 | -0.7% | -5.4% | -4.7% |
S5 | 40 | -0.8% | -6.0% | -5.3% |
平均变化（不含S0） | -1.6% | -4.4% | -3.9% | |
2.3.3 酶解深水鱼皮明胶与牛血清白蛋白临床数据对比
a.采用酶解深水鱼皮明胶（货号：ACH0085J）配成发光稀释液，用发光稀释液分别将磁珠包被T4抗体浓缩液、吖啶酯标记T4抗体浓缩液配置成工作液；
b.采用牛血清白蛋白（货号：DCL0001T）配成发光稀释液，用发光稀释液分别将磁珠包被T4抗体浓缩液、吖啶酯标记T4抗体浓缩液配置成工作液；
c.用a和b配成的工作液，分别测试TT4不同浓度的临床样本。如表4所示，两种缓冲体系下临床相关系数r均大于0.975，结果相当。含酶解深水鱼皮明胶缓冲体系测试的信噪比更优。因此，在T4项目上，酶解深水鱼皮明胶（货号：ACH0085J）可替代牛血清白蛋白（货号：DCL0001T）。
表4 酶解深水鱼皮明胶与牛血清白蛋白临床数据对比数据
序号 | TT4罗氏样本 浓度值 ug/dL | 含酶解深水鱼皮明胶 缓冲体系 | 含牛血清白蛋白 缓冲体系 |
发光值 | 发光值 | ||
1 | 1.43 | 48821 | 83958 |
4 | 1.85 | 77098 | 118731 |
8 | 2.40 | 148503 | 139248 |
9 | 3.40 | 221520 | 242465 |
12 | 4.37 | 398014 | 393013 |
15 | 5.83 | 594089 | 528993 |
18 | 6.96 | 775815 | 694465 |
22 | 7.57 | 766796 | 706264 |
26 | 8.52 | 987549 | 893024 |
30 | 9.76 | 1236330 | 1021238 |
32 | 10.10 | 1225415 | 1076131 |
33 | 11.50 | 1352271 | 1125118 |
37 | 14.60 | 1693892 | 1400102 |
40 | 15.60 | 1673493 | 1363475 |
43 | 16.90 | 1633366 | 1359156 |
44 | 17.40 | 1853622 | 1404460 |
45 | 18.50 | 1842468 | 1617591 |
50 | 20.80 | 2615908 | 2183121 |
51 | 22.90 | 2607963 | 2247072 |
临床相关性r | / | 0.987 | 0.984 |
信噪比 | 16.01 | 53.42 | 26.76 |
3.临床相关性
3.1化学发光（AE）平台：
3.1.1 西宝生物发光（AE）平台TT4抗体配对组合1与罗氏诊断的TT4试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2＞0.95，相关性较好；
3.1.2西宝生物发光（AE）平台FT4抗体配对组合1与罗氏诊断的FT4试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2＞0.95，相关性良好。
3.2化学发光（AP）平台：
3.2.1西宝生物发光（AP）平台TT4抗体配对组合2与罗氏诊断的TT4试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2＞0.95左右，相关性较好；
3.2.2西宝生物发光（AP）平台FT4抗体配对组合2与罗氏诊断的FT4试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2在0.94左右，相关性良好。
4. 测试方案
4.1化学发光（AE）平台
4.1.1 TT4抗体配对组合1
样本:样品加样量10ul；
试剂1：T4抗体（货号：EKY0325F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：T4抗体（货号：EKY0325G）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；
试剂3：总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用）（货号：DCH0209A）。
反应条件：
第一步：10ul预稀释样本+50ul试剂1+50ul 试剂2+50ul试剂3，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入预激发液及激发液，进行测试。
4.1.2 FT4抗体配对组合1
样本:样品加样量10ul；
试剂1：T4抗体（货号：EKY0325F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：T4抗体（货号：EKY0325G）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；
反应条件：
第一步：10ul预稀释样本+50ul试剂1+50ul 试剂2，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入预激发液及激发液，进行测试。
测试使用发光仪器:科斯迈SMART 500S。
4.2化学发光（AP）平台
4.2.1 TT4抗体配对组合2：
样本:样品加样量10ul；
试剂1：T4抗体（货号：EKY0325F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：T4抗体（货号：EKY0325G）标记-碱性磷酸酶稀释物，用量50ul/测试；
试剂3：总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用）（货号：DCH0209A）。
反应条件：
第一步：10ul预稀释样本+50ul试剂1+50ul 试剂2+50ul试剂3，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，进行测试。
4.2.2 FT4抗体配对组合2：
样本:样品加样量10ul；
试剂1：T4抗体（货号：EKY0325F）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：T4抗体（货号：EKY0325G）标记-碱性磷酸酶稀释物，用量50ul/测试；
反应条件：
第一步：10ul预稀释样本+50ul试剂1+50ul试剂2混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，进行测试。
测试使用发光仪器:迎凯Shine i2900。
5.产品信息
产品名称 | 货号 | 推荐配对 |
甲状腺素（T4）抗体 | EKY0325F | TT4配对： T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记吖啶酯+TT4解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）（发光配对组合1） T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4单抗（货号：EKY0325G）标记碱性磷酸酶+TT3/TT4解离剂（发光专用）（货号：DCH0208A）（发光配对组合2） |
甲状腺素（T4）抗体 | EKY0325G | |
甲状腺素（T4）抗体 | EKY0325F | FT4配对： T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记吖啶酯（发光配对组合1） T4抗体（货号：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗体（货号：EKY0325G）标记碱性磷酸酶（发光配对组合2） |
甲状腺素（T4）抗体 | EKY0325G | |
甲状腺素（T4），标准品 | DKY0346A | |
T4抗体（货号：）包被羧基磁珠浓缩液 | DKY1341A | |
T4抗体（货号：）吖啶酯浓缩液 | DKY1342A | |
T4抗体（货号：）标记碱性磷酸酶浓缩液 | DKY1342B | |
AMPPD 发光底物液（即用型） | DCD0517A | |
AMPPD 发光底物液（即用型） | DCD0517B | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
总甲状腺激素（TT4)解离液（发光专用） | DCH0209A | 同DCH0208A一样 |
酶解深水鱼皮明胶 | ACH0085J | 磁珠及标记物抗体稀释液。建议使用浓度1%-10%。 |
牛血清白蛋白(无蛋白酶,低脂肪酸,低lgG,内毒素) | DCL0001T-100g | 磁珠浓缩液、吖啶酯浓缩液、碱性磷酸酶浓缩液的稀释液中及包被及标记种封闭剂含有此款BSA可有效降低背景信号值及提高信噪比。建议使用浓度1%-2%。 |
DCL0001T-1Kg | ||
甲状腺素（T4）AE发光稀释液 | DCD0525A | |
甲状腺素（T4）AP酶标记物稀释液 | DCD0526A | |
甲状腺素（T4）标准品稀释液1 | DCD0527A | |
甲状腺素（T4）标准品稀释液2 | DCD0527B | |
复合酶保护剂AFP | ACE0074A | 建议使用浓度5%左右。 |
蛋白保护剂AEP-HBC | ACL0012A | 建议使用浓度5%左右。 |
复合酶稳定剂AES | ACE0070A | 建议使用浓度不高于4%。 |
