免疫分析试剂中常用封闭剂种类及选择

在免疫诊断试剂中，用于捕获目的分子的抗原或抗体往往固定在固相载体如孔板、微球、膜等载体上，这些载体广泛用于板式ELISA、免疫层析、乳胶比浊、化学发光、微流控技术等方法学的试剂盒中。固相载体结合捕获抗原或抗体后，由于载体表面未结合位点的暴露或表面电荷变化或表面亲疏水性的变化，都可能导致载体表面与样本或反应体系中的蛋白质或生物分子发生非特异性吸附结合，影响试剂的特异性和灵敏度，甚至引发假阳性或假阴性的错误结果。此外，由于载体表面的微环境发生变化，还可能影响试剂的聚集性而导致试剂稳定性下降。

为了减少并防止固相载体表面的这种非特异性吸附结合，通过不参与反应的物质对固相载体表面进行封闭是一种很有效的方法；封闭剂能填充载体表面未结合位点，减少非特异性结合，稳定固相表面，降低背景信号，提升检测的信噪比和准确性。

封闭剂对载体表面封闭的核心作用主要通过以下两种方式实现：

1.机械填补：利用合适分子量的蛋白分子（如BSA、血清蛋白等）填充载体表面物理孔隙，减少非特异结合分子的物理性穿透；

2.吸附覆盖：通过亲疏水作用或静电相互作用，封闭剂分子与载体表面形成单分子层覆盖。

理想的封闭剂应能有效封闭载体表面未结合的位点，但对载体表面固定的捕获分子的活性、结构和特异性都不影响；以实现降低载体表面非特异性结合、减少背景干扰、提高信噪比、稳定载体试剂的作用。

封闭剂种类繁多，常见的有：脱脂奶粉、BSA、酪蛋白酸钠、甘氨酸、明胶、血清、吐温、PEG、商品化合成封闭剂等。按封闭剂成分主要可以分为两大类：蛋白或氨基酸类和化学合成类封闭剂。

脱脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白酸钠、甘氨酸、明胶及动物血清等含蛋白或氨基酸的成分，都是常用于固相载体表面封闭的封闭剂；脱脂奶粉和BSA等都是常见而又广泛应用于免疫检测试剂中的封闭剂。

脱脂奶粉中含有多种蛋白质，如乳清蛋白和酪蛋白等，由于其含有不同分子量的蛋白种类多，且成本低廉、易获得的特点，被广泛用于WB和ELISA中的膜孔径封闭。但因其成分复杂的特点，也限制了主要用于定性检测试剂中。

而BSA和酪蛋白酸钠，则成分单一，且成本也较为低廉，适用于大多数应用常见，是脱脂奶粉不适用的应用场景中的有效替换解决方案；而且BSA和酪蛋白酸钠用作封闭剂也都获得了普遍的认可。但是， BSA由于含有少量脂肪酸或其他内源性物质，容易产生较为明显的批次间差异；此外，在部分应用场景如小分子或药物滥用检测中，由于BSA的免疫原性，可能会导致检测中出现针对BSA的交叉反应，这时可以选用酪蛋白酸钠或无蛋白的封闭剂进行替换。

鱼胶蛋白是一种小分子多肽，相较于常用的大分子蛋白，其与载体表面结合效果更好、封闭效率更高，可有效降低因封闭不足而导致的高背景。鱼胶蛋白常来源深水鱼皮，相比BSA和脱脂奶粉等动物来源，不会与哺乳动物蛋白质发生交叉反应；但因其可能含有内源性生物素，对biotin检测系统可能会存在一定干扰。

血清封闭剂中天然存在丰富的蛋白（如白蛋白、球蛋白等），能与固相载体表面或样本中的非特异结合物质进行结合或封闭，与BSA等原理类似；但是，样本中可能存在部分Fc受体，血清中的抗体可以与Fc受体结合，避免其对抗体的干扰和结合，这是常规蛋白或非蛋白类封闭剂无法替代的。血清封闭剂，来源丰富，对复杂表面封闭效果好，但血清中可能存在内源性残留干扰和物种间交叉反应的风险。

常见的一些非蛋白类化合物如：PVP、PEG、表面活性剂及商品化的合成聚合物封闭剂也都可以用于固相载体表面的封闭。

PVP、PEG都是水溶性的聚合物，可单独、也可与其它封闭剂联合使用，对载体表面起到封闭作用。PEG还可进一步通过侧链或两端的功能基团的修饰如氨基和羧基，增强其通过静电相互作用结合到载体表面，改善载体表面的亲水性。

表面活性剂如吐温20等非离子型、两亲型、离子型表面活性剂，可通过分子中的疏水链端与载体表面的疏水区域结合，通过亲水端或离子端的暴露，改善载体表面的亲水性或表面离子的稳定性。

商品化的化学合成封闭剂，通常是合成的嵌段聚合物，由亲水性的PEG长链和带一定电荷的短链构成，可通过载体表面与聚合物间的亲疏水相互作用或静电相互作用或表面共价偶联结合到载体表面，对其进行封闭及表面微环境改善，从而实现减少蛋白或分子非特异性结合的目的。

在体外诊断试剂开发中，科学选择封闭剂是确保检测结果准确性和灵敏度的重要环节。封闭剂的选择需要综合考虑技术平台、样本类型、分析物特征及成本等因素。

ELISA、Western Blot 等常规免疫检测中，脱脂奶粉、血清封闭剂凭借全面的封闭效果和高性价比成为优选；而对于高灵敏度化学发光、病原体抗体检测等场景，由于血清和脱脂奶粉的复杂成分和内源性成分干扰风险， BSA、酪蛋白或合成封闭剂等成为优选。此外，封闭剂的物种来源、批次间稳定性及生物安全性也是重要因素；只有经过系统验证封闭剂与检测系统的兼容性，才能更好的获得高质量、高稳定性的试剂性能。

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