细胞因子与免疫细胞疗法

细胞因子除了自身在免疫效应中有杀伤作用，也有着调控免疫细胞的关键作用，这也是实现免疫细胞体外大规模培养的重要基础。

免疫细胞的信号通路，依赖细胞因子的刺激实现激活细胞，增殖和分化，对有些细胞（比如一些NK细胞）是维持活性的营养所需。在免疫细胞疗法的生产工艺中，应用重组表达得到的细胞因子产品，对免疫细胞的培养而言，是不可或缺的关键原料。

对于通过多能诱导干细胞，获得治疗所需的免疫细胞，干细胞的诱导分化和培养扩增，需要分阶段逐次使用多种细胞因子。

 

在免疫细胞的培养中，有效使用多种细胞因子，可以产生叠加增强的调控作用。这也是在实践中，兼顾细胞的扩增规模、分化程度，以及活性疗效和治疗长效性，获得良好效果的实际策略。

IL-2又称为T细胞生长因子，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2通过与T细胞表面的IL-2受体（IL-2R）的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。IL-2与其家族的其他T细胞生长因子通过共用受体可活化和扩增CD4+与CD8+ T细胞。

IL-2对T细胞和NK细胞的激活作用通过自分泌和旁分泌方式进行。与T细胞不同，NK细胞不表达α受体亚单位，因此对IL-2亲和力较低。但IL-2能促进NK细胞增殖，增强细胞活性和其他细胞因子的分泌。B细胞也受IL-2激活、增殖和分化。

IL-7（白细胞介素 7 ）是 IL-2 相关细胞因子家族的一员，通过受体的γc（Gamma c）亚单位，刺激 T 细胞的存活、增殖与平衡。

IL-7 可替代 IL-2 用于 T 细胞活化，相对于IL-2，IL-7可大幅减轻对多个T细胞亚群的强烈刺激后的高度分化，减少了治疗中的T细胞耗竭，并可避免 IL-2 对 Treg 的激活引起的免疫耐受。有研究表明 IL-7 在注射疫苗或细胞治疗中可扩增抗原特异性 T 细胞；IL-7 也能够促进化疗或造血干细胞移植后的 T 细胞恢复。

白细胞介素15（Interleukin-15，IL-15）是IL-2细胞因子家族成员之一，通过γ c（gamma c）受体亚单位发挥生物学功能。IL-2与IL-15都参与早期T细胞增殖与激活，IL-15的抗肿瘤活性还来源于通过非抗原特异性方式直接激活CD8+效应T细胞。IL-15可对抗IL-2引起的细胞凋亡，并维持CD8+的记忆性T细胞，对维持长时间抗肿瘤活性非常重要。

IL-15和IL-7在细胞培养中的使用，能显著改善治疗中的T细胞耗竭的情况发生，是培养工艺中的关键原料。

白细胞介素21（Interleukin-21, IL-21）属于I类细胞因子，与IL-2、IL-4、IL-15等有较高的同源性，他们与IL-7，IL-9共用γ c (gamma c) 受体亚单位。体内IL-21由活化的CD4+ T细胞产生，具有多种生物学效应，刺激CD4+和CD8+ T细胞增殖，增强CD8+ T细胞和NK细胞毒性而不触发激活诱导的细胞死亡等。虽然IL-21在Th1/Th2分化中的作用机制尚未清楚，IL-21在体液免疫和天然免疫与获得性免疫之间的转换起到重要的调节作用。由于IL-21在增强体外抗原特异性T细胞增殖与分化中的重要功能，目前在免疫细胞治疗中被越来越广泛的应用。

白细胞介素12（Interleukin-12, IL-12）是一种异源二聚体的细胞因子，具有多种免疫调节功能，主要由树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞以及其他一些抗原递呈细胞（APC）产生。IL-12只有一种单一的高亲和力的受体，主要分布在激活的CD8+或CD4+ T细胞和CD56+ NK细胞的表面。IL-12能调节Th0细胞向Th1细胞分化，促进Th1细胞的增殖，诱导NK细胞和T细胞产生IFN-gamma，提高NK细胞、LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的形成等，具有良好的抗肿瘤作用。

白细胞介素18（Interleukin-1, IL-18）属IL-1家族，与IL-12相比具有更强的诱导产生IFN-gamma的能力。IL-18能刺激CD3单抗活化的T细胞增殖，也可作为NK细胞的激活剂，增强NK细胞的细胞毒性作用。此外，IL-18可与IL -12协同作用诱导产生IFN-gamma，提高NK细胞活性及促进T细胞增殖

IFN-γ对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。IFN-γ可上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达，从而增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。IFN-γ也会活化NK细胞，增强其细胞毒作用。

白细胞介素-4（IL-4）的生物作用包括刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+ T细胞分化成II型辅助T细胞。DC培养中，IL-4和GM-CSF共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC。

其他细胞因子蛋白，包括IL-6、TGF-β1、FLT3L等，对调控体内T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等免疫细胞的增殖、分化和成熟，起着重要的作用。

 

针对肿瘤疾病的CAR-T治疗细胞中，CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例一般接近1：1。CD4+T细胞主要分泌细胞因子，CD8+T细胞更多地产生直接杀伤肿瘤细胞的作用。

通过模拟树突状细胞在体外诱导CD3/CD28介导的T细胞活化，在细胞培养基中加入IL-2、IL-15、IL-7等因子，以维持CD8+T细胞的活化和扩增。

针对自免疾病（红斑狼疮等）的CAR-T疗法中，治疗效用主要依靠Treg细胞，起到调控过度免疫的作用。通过给Treg装上能特异性识别自身组织或移植物抗原的CAR，可以将其精准招募到炎症部位，局部、高效地抑制免疫攻击，从而治疗1型糖尿病、红斑狼疮、器官移植排斥等疾病。

 

NK细胞的完全活化、增殖、存活和效应功能通常需要不同细胞因子的组合。正调节NK细胞功能的细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21和IFN-γ（主要由Th1细胞、巨噬细胞和树突状细胞生成）。相反，细胞因子IL-4、IL-5和IL-10（由Th2细胞分泌）或者IL-1β、IL-6、IL-10、IL-23、IL-35和TGF-β（由肿瘤细胞分泌）可抑制NK细胞功能。

iPS细胞（ induced pluripotent stem cells，iPSCs ），也叫诱导多能干细胞。2006年，日本京都大学山中伸弥教授在 Cell 期刊发表论文，发现将 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 这四种转录因子通过病毒载体导入成熟体细胞后，可将体细胞转化为诱导多能干细胞（iPSC）。iPSC来源的细胞治疗，有几大优势。

iPSC作为细胞疗法的原材料可提供大量细胞来源，能够逾越供体细胞来源及细胞体外扩增能力的限制。

iPSC的分化潜能使其通过筛选具有CAR表达的单个克隆，体外诱导分化为免疫细胞，可以免除大批量GMP级别的载体、病毒制备及质控检测工艺流程及步骤，降低成本并产出质量均一的细胞产品。

iPSC结合目前发展极为迅速的基因编辑技术，将细胞上导致免疫排斥的基因敲除，可解决人体的免疫排斥反应，产出可如一般药品在大量生产后贮藏、随时供患者使用的通用型免疫细胞治疗产品，扩大受益患者群体。

 

通过对iPSC的诱导分化，得到用于治疗的T细胞，然后对从iPSC得到的T细胞改造，获得CAR-T，大规模扩增后得到治疗用产品

根据目前比较成熟的培养方法，iPSC诱导分化的CAR-T大约需要30天的培养时间。细胞分化、激活并扩增的过程，需根据培养阶段加入不同的细胞因子组合，具体组合如上图所示。

通过对iPSC的诱导分化，得到用于治疗的NK细胞，然后对NK细胞改造，获得CAR-NK，大规模扩增后得到治疗用产品

根据目前比较成熟的培养方法，iPSC诱导分化的CAR-NK需要一个多月的培养时间。细胞分化、激活并扩增的过程，需根据培养阶段加入不同的细胞因子组合，具体组合如上图所示。