摘要：研究针对真核生物中N6-甲基腺嘌呤（6mA）的存在与功能争议，通过牛津纳米孔测序技术对18种单细胞真核生物进行碱基分辨率6mA分析。
在真核生物表观遗传学领域，DNA甲基化作为基因表达的关键调控机制一直备受关注。5-甲基胞嘧啶（5mC）作为最典型的DNA甲基化形式，其功能和机制已被广泛研究。然而，另一种甲基化形式——N6-甲基腺嘌呤（6mA）在真核生物中的存在和功能却长期存在争议。许多相互矛盾的研究报告使得科学界对6mA在真核基因组中的真实作用莫衷一是。这种不确定性主要源于方法学上的局限性，特别是检测技术可能带来的假象。
尽管如此，一些单细胞真系，包括纤毛虫、早期分支真菌和藻类衣藻，确实显示出强烈的6mA信号，这引发了关于其起源和进化作用的疑问。为了解决这些争议，由Alex de Mendoza领导的研究团队在《Nature Genetics》上发表了突破性研究，通过先进的技术手段揭示了6mA在真核生物中的广泛存在和进化意义。
图1 肥胖重塑脂肪组织中CD8+ T细胞的铁代谢以加剧代谢性炎症
研究人员应用牛津纳米孔测序技术，以碱基对分辨率分析了代表所有主要超群的18种单细胞真核生物的6mA模式。他们发现，强烈的6mA模式仅出现在编码腺嘌呤甲基转移酶AMT1的物种中。值得注意的是，6mA持续积累在转录起始位点下游，位于H3K4me3标记的核小体之间，表明其与转录激活存在保守关联。
研究团队采用的主要技术方法包括：对231种真核生物基因组和转录组进行MT-A70甲基转移酶系统发育分析；使用牛津纳米孔R9.4.1和R10.4.1技术对18种真核生物进行全基因组DNA测序和修饰碱基识别；通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析组蛋白修饰H3K4me3和H3K27ac的分布；利用RNA-seq进行基因表达分析；并对四种真核生物进行H3K4me3抑制剂处理实验，以研究组蛋白修饰与6mA沉积的因果关系。
AMT1是祖先基因但在真核生物中反复丢失
为了阐明MT-A70甲基转移酶的起源和进化，研究人员检查了231个真核生物基因组和转录组。系统发育分析显示，MT-A70家族包括六个已确立的真核生物家族：AMT1、AMT6/7、AMT2/5、METTL3、METTL14和METTL4。值得注意的是，原核生物序列形成了一个独特的进化枝，表明MT-A70具有细菌起源，在真核生物进化早期被继承。
研究发现，所有六个MT-A70家族都存在于大多数真核生物超群中，表明它们在最后真核生物共同祖先（LECA）之前已经复制。RNA相关的METTL3和METTL14在整个物种系统发育中共同出现，模式类似于DNA相关的AMT1和AMT6/7，表明这两种酶对在真核生物中具有保守的异源二聚体关联。
6mA在编码AMT1的物种中与转录相关
基于AMT1的分布，研究人员搜索了具有可检测基因组6mA的真核生物谱系。为了避免细菌污染，他们专注于无菌培养的物种。研究选择包括15个编码AMT1的物种和3个缺乏AMT1直系同源物作为阴性对照的物种。
在所有编码AMT1的物种中，AT是主要的甲基化背景，尽管AA也显示出明显的甲基化水平。ApT位点在所有编码AMT1的物种中显示对称甲基化。相比之下，缺乏AMT1的物种在二核苷酸背景中的差异可忽略不计，AA二核苷酸富集程度最高。
研究人员随后检查了6mA的基因组分布。在缺乏AMT1的物种中，6mA在基因和转座子（TE）中均匀出现，与背景噪声一致。相反，在编码AMT1的物种中，AT甲基化峰值出现在转录起始位点（TSS）附近。基因内6mA与基因转录活性相关。
阶段特异性转录独立于6mA发生
研究人员测试了6mA在转录变化时的可变性。他们选择了变形虫A. castellanii、真菌S. punctatus、鱼孢菌C. fragrantissima和C. perkinsii，因为这些生物具有不同的细胞阶段，可以在培养中分离。
所有物种在ApT和基因水平分辨率上呈现静态的6mA甲基化组，大多数基因显示最小的6mA差异。在N. gruberi中，使用R9纳米孔化学称为甲基化的644个基因，在23°C和30°C下显示可比较的6mA水平，尽管使用了R10化学和不同的分析流程。当计算阶段间差异表达基因的总数，并将这些与沿基因体显示>1% 6mApT水平变化的基因重叠时，研究人员观察到数千个基因改变表达而没有任何可检测的6mA改变。
5mC和6mA在真核生物中标记不同功能
由于5mC是真核生物中另一种广泛的DNA甲基化形式，研究人员检查了其与6mA在他们物种集中的关系。他们发现了多样的情况——物种表现出不可检测的5mC水平伴随高6mA，而其他物种专门含有5mC。一些物种呈现两种修饰，而盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）两种都没有。
研究人员发现，6mA的突变效应在富集区域最为明显，特别是在TSS后。在大多数物种中，6mA与ApT组成没有明显关联。在一些物种中，甲基化基因比未甲基化基因具有更高的ApT密度，与5mC看到的模式相反。带有H3K4me3的核小体与6mA共定位
研究结果与先前报告一致，表明6mA在核小体连接DNA中富集。在纤毛虫中，删除AMT1破坏了6mA模式，导致TSS周围核小体定位更加分散。数据集中的大多数物种也显示周期性6mA模式。
为了探究什么塑造了6mA模式及其与核小体的联系，研究人员对两个TSS相关和转录活性组蛋白标记——组蛋白3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）和赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）。
两个组蛋白标记显示预期的TSS后富集，峰值宽度小于1,000 bp。研究人员随后按H3K4me3信号对基因进行分组，发现6mA与这种组蛋白标记紧密重叠。相比之下，H3K4me3峰值之外的基因组区域在所有物种中具有显著较低的6mA水平。
为了直接测试H3K4me3沉积是否影响6mA存在，研究人员用H3K4me3抑制剂处理A. castellanii。他们使用OICR-9429和Piribedil，这些抑制剂阻断WDR5与组蛋白甲基转移酶的相互作用。两种抑制剂导致H3K4me3水平的剂量依赖性降低，而总H3水平不受影响。在最高抑制剂浓度下，研究人员分析了处理和DMSO对照样品中的6mA甲基化组。此外，6mA水平在抑制剂和对照组之间显示最小差异，无论是全局还是在H3K4me3峰值上，表明H3K4me3不直接决定这些物种中的6mA沉积。
图2 MT-A70 6-甲基腺嘌呤甲基转移酶的起源与反复丢失
这项研究证实了6mA在真核生物中的广泛存在，并追踪其起源至最后真核生物共同祖先（LECA）。广泛的采样支持了一个祖先的AMT1通路，与真核生物生命树的有争议的根位置无关。与5mC DNMTs通过独立细菌转移被LECA获取不同，6mA MT-A70甲基转移酶可能通过单一事件从细菌供体继承。
研究证实牛津纳米孔作为6mA检测的可靠平台，展示了在具有不同基因组组成的物种中强大且可重复的模式。长读长碱基对分辨率图谱避免了其他方法的缺陷。作为一个例子，在T. vaginalis中，基于抗体的下拉表明6mA在Maverick反转录转座子中富集，其中短读长映射伪像很常见。相比之下，纳米孔数据在转录基因上显示强烈的周期性6mA模式，而在TE中没有富集，与其他真核生物的模式一致。
AMT1通路反复丢失的发现挑战了关于DNA甲基化进化的假设。与DNMTs和RNA m6A METTL3/METTL14通路类似，6mA-AMT1通路在真核生物中经常丢失。由于6mA没有明显的突变效应，这些丢失可能反映了进化偶然性，6mA的作用被替代机制补偿。这在现存真核生物中产生了6mA和5mC的不同组合。
因此，6mA与转录强烈相关，在高度表达基因中富集，但其动态性似乎有限。在数据集中的五个物种中，6mA在转录扰动下显示微小变化。在另一个最近发表的例子中，真菌Phycomyces blakesleeanus和Mucor lusitanicus也显示适度的6mA动态，尽管有处理特定的转录变化。类似地，纤毛虫和M. lusitanicus中的AMT1敲除导致有限的转录变化，而发育转录变化很少改变5mC模式。
6mA在核小体定位中的功能仍不清楚，因为具有突变AMT1的纤毛虫表现无序核小体，但通常仍然可行，主要在性繁殖中致命地受影响。考虑到H3K4me3作为TSS后标记的广泛存在，即使在缺乏6mA的物种中，后者可能非必需或容易在该区域被替代。值得注意的是，H3K4me3和H2A.Z通常与真核生物中的5mC反相关，因此H3K4me3-6mA联系可能进一步促进染色质区室化。
在鱼孢菌中，p1 PHD域表明可能的H3K4me3识别。因此，H3K4me3-6mA之间的层次关系可能独立进化，或者它们的共存可能仅仅反映转录的下游结果，而不是直接因果联系。生物物理上，6mA被认为降低双链DNA稳定性，这种效应可能有利于高度表达基因起始处的转录。然而，要理解6mA作为表观遗传标记的作用，识别潜在阅读器是关键。类似地，尽管5mC使DNA变硬，但其在真核生物中的功能更依赖于相关阅读器或抑制转录因子结合，而不是内在生物物理特性。
有趣的是，5mC主要保留在主要多细胞真核生物谱系（植物、动物和双核菌）中，而AMT1-6mA通路在这些谱系中丢失。在植物和动物中，5mC进化为甲基化基因体，取代TSS后区域中的6mA，但这种替代不可能是6mA丢失的唯一原因。植物和动物的单细胞亲属具有与6mA共存的基因体5mC，表明6mA和5mC具有独特作用，即使发现在相同区域。
总之，这些数据重塑了对6mA功能和进化的理解，强调6mA和5mC都是原始真核生物染色质工具包的组成部分。尽管纤毛虫引领了我们对真核生物中6mA的理解，它们 drastically 不寻常的基因组组织，具有小核和大核，以及MT-A70s的谱系特异性扩展，将受益于来自替代谱系的补充见解。通过将分类单元采样扩展到具有规范基因组的易处理物种，这项工作为阐明6mA功能和理解为什么该通路在主要多细胞谱系中丢失奠定了基础。
参考资料
[1] Adenine DNA methylation associated with transcriptionally permissive chromatin is widespread across eukaryotes
摘要：研究针对真核生物中N6-甲基腺嘌呤（6mA）的存在与功能争议，通过牛津纳米孔测序技术对18种单细胞真核生物进行碱基分辨率6mA分析。
在真核生物表观遗传学领域，DNA甲基化作为基因表达的关键调控机制一直备受关注。5-甲基胞嘧啶（5mC）作为最典型的DNA甲基化形式，其功能和机制已被广泛研究。然而，另一种甲基化形式——N6-甲基腺嘌呤（6mA）在真核生物中的存在和功能却长期存在争议。许多相互矛盾的研究报告使得科学界对6mA在真核基因组中的真实作用莫衷一是。这种不确定性主要源于方法学上的局限性，特别是检测技术可能带来的假象。
尽管如此，一些单细胞真系，包括纤毛虫、早期分支真菌和藻类衣藻，确实显示出强烈的6mA信号，这引发了关于其起源和进化作用的疑问。为了解决这些争议，由Alex de Mendoza领导的研究团队在《Nature Genetics》上发表了突破性研究，通过先进的技术手段揭示了6mA在真核生物中的广泛存在和进化意义。
图1 肥胖重塑脂肪组织中CD8+ T细胞的铁代谢以加剧代谢性炎症
研究人员应用牛津纳米孔测序技术，以碱基对分辨率分析了代表所有主要超群的18种单细胞真核生物的6mA模式。他们发现，强烈的6mA模式仅出现在编码腺嘌呤甲基转移酶AMT1的物种中。值得注意的是，6mA持续积累在转录起始位点下游，位于H3K4me3标记的核小体之间，表明其与转录激活存在保守关联。
研究团队采用的主要技术方法包括：对231种真核生物基因组和转录组进行MT-A70甲基转移酶系统发育分析；使用牛津纳米孔R9.4.1和R10.4.1技术对18种真核生物进行全基因组DNA测序和修饰碱基识别；通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析组蛋白修饰H3K4me3和H3K27ac的分布；利用RNA-seq进行基因表达分析；并对四种真核生物进行H3K4me3抑制剂处理实验，以研究组蛋白修饰与6mA沉积的因果关系。
AMT1是祖先基因但在真核生物中反复丢失
为了阐明MT-A70甲基转移酶的起源和进化，研究人员检查了231个真核生物基因组和转录组。系统发育分析显示，MT-A70家族包括六个已确立的真核生物家族：AMT1、AMT6/7、AMT2/5、METTL3、METTL14和METTL4。值得注意的是，原核生物序列形成了一个独特的进化枝，表明MT-A70具有细菌起源，在真核生物进化早期被继承。
研究发现，所有六个MT-A70家族都存在于大多数真核生物超群中，表明它们在最后真核生物共同祖先（LECA）之前已经复制。RNA相关的METTL3和METTL14在整个物种系统发育中共同出现，模式类似于DNA相关的AMT1和AMT6/7，表明这两种酶对在真核生物中具有保守的异源二聚体关联。
6mA在编码AMT1的物种中与转录相关
基于AMT1的分布，研究人员搜索了具有可检测基因组6mA的真核生物谱系。为了避免细菌污染，他们专注于无菌培养的物种。研究选择包括15个编码AMT1的物种和3个缺乏AMT1直系同源物作为阴性对照的物种。
在所有编码AMT1的物种中，AT是主要的甲基化背景，尽管AA也显示出明显的甲基化水平。ApT位点在所有编码AMT1的物种中显示对称甲基化。相比之下，缺乏AMT1的物种在二核苷酸背景中的差异可忽略不计，AA二核苷酸富集程度最高。
研究人员随后检查了6mA的基因组分布。在缺乏AMT1的物种中，6mA在基因和转座子（TE）中均匀出现，与背景噪声一致。相反，在编码AMT1的物种中，AT甲基化峰值出现在转录起始位点（TSS）附近。基因内6mA与基因转录活性相关。
阶段特异性转录独立于6mA发生
研究人员测试了6mA在转录变化时的可变性。他们选择了变形虫A. castellanii、真菌S. punctatus、鱼孢菌C. fragrantissima和C. perkinsii，因为这些生物具有不同的细胞阶段，可以在培养中分离。
所有物种在ApT和基因水平分辨率上呈现静态的6mA甲基化组，大多数基因显示最小的6mA差异。在N. gruberi中，使用R9纳米孔化学称为甲基化的644个基因，在23°C和30°C下显示可比较的6mA水平，尽管使用了R10化学和不同的分析流程。当计算阶段间差异表达基因的总数，并将这些与沿基因体显示>1% 6mApT水平变化的基因重叠时，研究人员观察到数千个基因改变表达而没有任何可检测的6mA改变。
5mC和6mA在真核生物中标记不同功能
由于5mC是真核生物中另一种广泛的DNA甲基化形式，研究人员检查了其与6mA在他们物种集中的关系。他们发现了多样的情况——物种表现出不可检测的5mC水平伴随高6mA，而其他物种专门含有5mC。一些物种呈现两种修饰，而盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）两种都没有。
研究人员发现，6mA的突变效应在富集区域最为明显，特别是在TSS后。在大多数物种中，6mA与ApT组成没有明显关联。在一些物种中，甲基化基因比未甲基化基因具有更高的ApT密度，与5mC看到的模式相反。带有H3K4me3的核小体与6mA共定位
研究结果与先前报告一致，表明6mA在核小体连接DNA中富集。在纤毛虫中，删除AMT1破坏了6mA模式，导致TSS周围核小体定位更加分散。数据集中的大多数物种也显示周期性6mA模式。
为了探究什么塑造了6mA模式及其与核小体的联系，研究人员对两个TSS相关和转录活性组蛋白标记——组蛋白3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）和赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）。
两个组蛋白标记显示预期的TSS后富集，峰值宽度小于1,000 bp。研究人员随后按H3K4me3信号对基因进行分组，发现6mA与这种组蛋白标记紧密重叠。相比之下，H3K4me3峰值之外的基因组区域在所有物种中具有显著较低的6mA水平。
为了直接测试H3K4me3沉积是否影响6mA存在，研究人员用H3K4me3抑制剂处理A. castellanii。他们使用OICR-9429和Piribedil，这些抑制剂阻断WDR5与组蛋白甲基转移酶的相互作用。两种抑制剂导致H3K4me3水平的剂量依赖性降低，而总H3水平不受影响。在最高抑制剂浓度下，研究人员分析了处理和DMSO对照样品中的6mA甲基化组。此外，6mA水平在抑制剂和对照组之间显示最小差异，无论是全局还是在H3K4me3峰值上，表明H3K4me3不直接决定这些物种中的6mA沉积。
图2 MT-A70 6-甲基腺嘌呤甲基转移酶的起源与反复丢失
这项研究证实了6mA在真核生物中的广泛存在，并追踪其起源至最后真核生物共同祖先（LECA）。广泛的采样支持了一个祖先的AMT1通路，与真核生物生命树的有争议的根位置无关。与5mC DNMTs通过独立细菌转移被LECA获取不同，6mA MT-A70甲基转移酶可能通过单一事件从细菌供体继承。
研究证实牛津纳米孔作为6mA检测的可靠平台，展示了在具有不同基因组组成的物种中强大且可重复的模式。长读长碱基对分辨率图谱避免了其他方法的缺陷。作为一个例子，在T. vaginalis中，基于抗体的下拉表明6mA在Maverick反转录转座子中富集，其中短读长映射伪像很常见。相比之下，纳米孔数据在转录基因上显示强烈的周期性6mA模式，而在TE中没有富集，与其他真核生物的模式一致。
AMT1通路反复丢失的发现挑战了关于DNA甲基化进化的假设。与DNMTs和RNA m6A METTL3/METTL14通路类似，6mA-AMT1通路在真核生物中经常丢失。由于6mA没有明显的突变效应，这些丢失可能反映了进化偶然性，6mA的作用被替代机制补偿。这在现存真核生物中产生了6mA和5mC的不同组合。
因此，6mA与转录强烈相关，在高度表达基因中富集，但其动态性似乎有限。在数据集中的五个物种中，6mA在转录扰动下显示微小变化。在另一个最近发表的例子中，真菌Phycomyces blakesleeanus和Mucor lusitanicus也显示适度的6mA动态，尽管有处理特定的转录变化。类似地，纤毛虫和M. lusitanicus中的AMT1敲除导致有限的转录变化，而发育转录变化很少改变5mC模式。
6mA在核小体定位中的功能仍不清楚，因为具有突变AMT1的纤毛虫表现无序核小体，但通常仍然可行，主要在性繁殖中致命地受影响。考虑到H3K4me3作为TSS后标记的广泛存在，即使在缺乏6mA的物种中，后者可能非必需或容易在该区域被替代。值得注意的是，H3K4me3和H2A.Z通常与真核生物中的5mC反相关，因此H3K4me3-6mA联系可能进一步促进染色质区室化。
在鱼孢菌中，p1 PHD域表明可能的H3K4me3识别。因此，H3K4me3-6mA之间的层次关系可能独立进化，或者它们的共存可能仅仅反映转录的下游结果，而不是直接因果联系。生物物理上，6mA被认为降低双链DNA稳定性，这种效应可能有利于高度表达基因起始处的转录。然而，要理解6mA作为表观遗传标记的作用，识别潜在阅读器是关键。类似地，尽管5mC使DNA变硬，但其在真核生物中的功能更依赖于相关阅读器或抑制转录因子结合，而不是内在生物物理特性。
有趣的是，5mC主要保留在主要多细胞真核生物谱系（植物、动物和双核菌）中，而AMT1-6mA通路在这些谱系中丢失。在植物和动物中，5mC进化为甲基化基因体，取代TSS后区域中的6mA，但这种替代不可能是6mA丢失的唯一原因。植物和动物的单细胞亲属具有与6mA共存的基因体5mC，表明6mA和5mC具有独特作用，即使发现在相同区域。
总之，这些数据重塑了对6mA功能和进化的理解，强调6mA和5mC都是原始真核生物染色质工具包的组成部分。尽管纤毛虫引领了我们对真核生物中6mA的理解，它们 drastically 不寻常的基因组组织，具有小核和大核，以及MT-A70s的谱系特异性扩展，将受益于来自替代谱系的补充见解。通过将分类单元采样扩展到具有规范基因组的易处理物种，这项工作为阐明6mA功能和理解为什么该通路在主要多细胞谱系中丢失奠定了基础。
参考资料
[1] Adenine DNA methylation associated with transcriptionally permissive chromatin is widespread across eukaryotes
