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免疫比浊项目解决方案

发布时间:2021-06-07 点击数:1183
胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。相对于Elisa方法,省去了孵育和洗板的步骤,几分钟就能获得结果;相对于金标法具有更高的灵敏度,可用于定量检测。
优点
(1)操作简单,可在几分钟内快速、准确地检测含量,真实反映病情进展和评估治疗效果,对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的临床意义;
(2)不易受人为操作和外界因素干扰,检测稳定性和重复性都很好;
(3)能利用普通的生化分析仪进行检测,容易实现自动化,可在各级基层医疗机构普及和应用。
影响共价偶联的因素
A 活性基团和偶联试剂
1、配体
因为活性和结合动力学是高度依赖于固定化分子的取向,故可用于偶联和修饰的活性基团必须慎重考虑。
2、微球
生物分子可通过各种表面化学试剂偶联到聚合物或硅基微球上。可用的表面官能团包括:聚合-羧基和氨基(常用的)以及羟基、肼基和氯甲基;和硅-醇硅基、羧基。
部分产品列表
产品名称氨基聚苯乙烯微球羟基聚苯乙烯微球羧基聚苯乙烯微球
固含量2.5% ~ 5% w/v5% w/v2.5% ~ 5% w/v
粒径0.2-8um0.7-0.9um0.05-8um
规格10ml, 100ml10ml, 100ml10ml, 100ml
3、交联剂
交联剂可用于活跃含水环境中表现出低反应活性的基团(碳二亚胺与羧基结合),或者加入到对彼此没有反应的基团中(如氨基与氨基结合)
部分产品列表
英文品名中文品名CAS规格
EDC1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐25952-53-85g, 25 g
NHSN-羟基琥珀酰亚胺6066-82-6100g
Sulfo-NHSN-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐106627-54-710g, 50g
SMCC琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物64987-85-550mg
Sulfo-SMCC硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物92921-24-950mg, 1g
B 微球组成
微球的特定组成将决定其特性,如如疏水性或亲水性,正电荷或负电荷,表面电荷密度等,这些特点都会对其承载能力有一定影响。也就是说,生物分子怎么有效地进入化学基团附近,以便可能发生偶联。他们还将影响非特异性结合特性,但非特异性结合可能与阻断剂、缓冲液及检测的条件(如:样品稀释)等有关。
C 试剂的质量
试剂的质量对成功的偶联是至关重要的,并影响包被微球的性能。遵从制造商的指引
用于试剂调制,使用,存储,和过期应观察到保证活性和稳定性,并且采取措施防止污染。
D、试剂的浓度
确定不同试剂的适当浓度,比如配体或交联剂,对控制表面密度很重要。使用太少会导致包被不是较理想且活性低。使用太多会导致微球“过载”(空间位阻效应,减少活性)或者单纯地浪费昂贵的试剂。
E、缓冲液
1、总论
缓冲液的选择和具体方案(配体和反应基团)有关。在选择缓冲液时,考虑到与配体的相容性。此外,还要考虑到缓冲液中不能包含参与或干扰反应的化合物。比如,磷酸盐和醋酸盐缓冲液会降低碳二亚胺的反应活性,因此不建议在羧基微球偶联中作为活跃冲液使用。在这种情况下,一种流行的替代是使用MES。又如,在与胺活性化学物质作用时,应避免含有游离胺的缓冲液(Tris或甘氨酸)。
2、配方中常用的缓冲液
a、磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.4
i. 磷酸氢二钾: 1.82 g/L (MW 174.2)
ii. 磷酸二氢钠: 0.22 g/L (MW 120.0)
iii. 氯化钠: 8.76 g/L (MW 58.4)
用去离子水并定容至1L,用1N盐酸或1N氢氧化钠调节pH至7.4.
b、硼酸盐缓冲液 pH8.5
i. 硼酸, H3BO3: 12.4 g/L (MW 61.8)
ii. 硼氢化钠: 19.1 g/L (MW 381.4)
加入50mL硼酸溶液至14.5mL硼氢化钠溶液中,用去离子水并定容至200mL。用3M的氢氧化钠 调节pH至8.5.
c、醋酸盐缓冲液 pH3.6~5.6
i. 0.1 M 醋酸: (5.8mL制备1000mL)
ii. 0.1 M 醋酸钠: 8.2 g/L (无水, MW 82.0)
按如下所示比例混合醋酸和醋酸钠溶液,用去离子水并定容至100mL。用1N盐酸或 1N氢氧化钠调节pH。
醋酸/mL46.341.030.520.014.810.54.8
醋酸钠/mL3.79.019.530.035.239.545.2
pH3.64.04.44.85.05.25.6
d、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液 pH2.6~7.0
i. 0.1 M 柠檬酸: 19.2 g/L (MW 192.1)
ii. 0.2 M 磷酸氢二钠: 35.6 g/L (二水, MW 178.0)
按如下所示比例混合柠檬酸和磷酸氢二钠溶液,用去离子水并定容至100mL。用1N 盐酸或1N氢氧化钠调节pH。
柠檬酸/mL44.635.929.424.319.713.66.5
磷酸氢二钠/mL5.414.120.625.730.336.443.6
pH2.63.44.25.05.86.67.0
e、碳酸盐-碳酸氢钠缓冲液 pH9.2-10.4
i. 0.1 M 碳酸钠: 10.6 g/L (无水, MW 106.0)
ii. 0.1 M 碳酸氢钠: 8.4 g/L (MW 84.0)
按如下所示比例混合碳酸钠和碳酸氢钠溶液,用去离子水并定容至200mL。用1N 盐酸或1N氢氧化钠调节pH。
碳酸钠/mL4.09.516.022.027.533.038.5
碳酸氢钠/mL46.040.534.028.022.517.011.5
pH9.29.49.69.810.010.210.4
f、MES缓冲液 pH5.7~7.2
溶解21.3gMES一水物至约900mL的纯水中。用1N盐酸或1N氢氧化钠滴定至所需的pH并用纯水定容至1000mL。
部分产品列表
货号英文品名中文品名CAS规格
AHD0132ADipotassium hydrogenphosphate磷酸氢二钾7758-11-4500g
AHD0031ASodium phosphate monobasic dihydrate磷酸二氢钠13472-35-0500g
AHD0022ASodium chloride氯化钠7647-14-5500g
AHB0001CBoric acid硼酸10043-35-3500g
AHD0065ASodium acetate醋酸钠127-09-3500g
ALA0003BCitric acid anhydrous柠檬酸77-92-9500g
AHD0017ASodium phosphate dibasic dihydrate磷酸氢二钠10028-24-7 500g
AHD0112ASodium carbonate, anhydrous碳酸钠497-19-8500g
AHD0119ASodium hydrogen carbonate碳酸氢钠144-55-8500g
ACC0016AMES monohydrate2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水145224-94-8500g
ACC0018AMOPSO3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸68399-77-91Kg
ACC0013AHEPESN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸7365-45-91Kg
*胶乳溶液一般常用低浓度的Good's缓冲液储存。
3、抗菌剂
低浓度(0.05%-0.1%)的抗菌剂,例如叠氮钠或硫柳汞,经常被加入到储存缓冲液中,特别是长期储存的时候。抗菌剂的选择要谨慎,因为他们可能会展现出不同的稳定性,涉及到特殊处理事项等。例如,叠氮钠与铅、铜管道反应会生成易爆的叠氮金属化合物,因此,在清理材料时,要用大量的水冲洗管道并防止叠氮化物积累。
F、阻断剂
阻断剂通常在偶联反应后用于包被微球,可以使微球与非目标分子的非特异性结合变小。阻断剂应谨慎选择,以确保它可以有效地减少非特异性相互作用。某些阻断剂可能会干扰检测,或实际上有助于非特异性结合。对阻断剂的浓度进行评估,确保有足够的阻挡而没有显著的活性损失。阻断剂通常以不同的量加入到储存缓冲液中,标准浓度为0.05~0.1%中的任意值。在一个独立的孵育中,为了饱和微球的暴露表面,建议在储存前用更高浓度的阻断剂(1%)。以下是一些常用的阻断剂:
a. BSA(牛血清白蛋白):经常单独使用,但是可以和其他的阻断剂复合使用,常用的表面活性剂。
b. 酪蛋白:一种牛奶基质的蛋白质,含有生物素原,在工作系统涉及生物素时应避免使用以防止干扰。
c. Pepticase(酪蛋白酶解产物):酪蛋白的酶促衍生物,当工作系统涉及生物素时同样应该避免。
d. 非离子表面活性剂:吐温20和Triton(R)X-100是典型的。当与另一种阻断剂使用时,一个常用的比例为1%阻滞剂; 0.05%的表面活性剂。
e. 不相关的“IgG”:经常在标记特性IgG到微球上时使用。例如:如果偶联小鼠IgG,兔(或任一非交联反应的IgG)可以用作阻断剂被吸附。
f. FSG(鱼皮明胶):纯明胶或明胶水解产物也可使用。
g. PEG(聚乙二醇):一个多功能的阻断剂,可提供不同的分子量、结构和负载。
h. 血清:非交联反应血清,如马血清或鱼血清,在与各类抗体的交联反应中都有很强的惰性。
i. 商业阻滞剂:许多公司提供制剂,其是各种分子量的两种或更多种单阻断物质的复合,并且其可以有效地在宽范围的条件下使用。这些以不同的商品名称出售,而大多数化学厂商将提供多种。
阻断剂的品种还有许多,我们建议尝试各种组合和浓度。
产品列表
货号英文品名中文品名CAS规格
DCL0001ABSA牛血清白蛋白9048-46-8500g
ACL0017ACasein From Bovine Milk Sodium酪蛋白9005-46-31Kg
P1192Pepticase酪蛋白酶解产物 250g, 5Kg
ACH0027ATween 20吐温209005-64-55L
ACH0026ATriton X-100曲拉通X-1009002-93-1500mL, 5L
ACH0085CGelatin from fish skin鱼皮明胶9000-70-8100g
G、微球的处理
微球的处理对偶联过程的结果有着显著的影响。研究人员应该先考虑微球的清洗过程,这会影响偶联的效率,微球的损失等。在过程控制中应当对其的单分散性进行监控,如果观察到凝集则需要处理。
H、其他
还有其他参数可以被评估,包括培养时间和温度,试剂添加的顺序和速度等。
胶乳微球使用中常见问题及解答
【问题】:如何选择微球粒径?
【回答】:一般选择粒径小的胶乳微球,则需要的抗体量就多,精密度和线性相对较好,而选择粒径大的胶乳微球性,则所需抗体少,精密度和线性相对较差,相对于小球,大球的灵敏度较好。
【问题】:胶乳的自凝现象如何控制和避免?
【回答】:胶乳自凝与许多因素有关,如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平,使得表面的价负荷被掩蔽,胶乳微球之间发生接触,于是便产生凝集,故高离子强度的缓冲溶液不应使用,缓冲溶液的的浓度不要超过 50mM,但有些 CML 胶乳微球具有高电荷密度,则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球,不能使用阳电荷的缓冲溶液如 Tris 缓冲溶液,因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时,悬浮介质的pH值应至少保持在比胶乳微球表面基团的 pKa 值高1-2pH单位。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不稳定,故胶乳微球的浓度尽量以低浓度为宜,胶乳微球也不能受冷冻,否则会凝集。
【问题】:微球与抗体偶联应选用一步法还是二步法?
【回答】:一步法是将微球、抗体、偶联剂一起加入到体系中进行反应,更适用于小分子的偶联,比如:类固醇、半抗原。
【问题】:微球与抗体偶联后,当时没发现有凝集,但隔夜后发现有凝集,这是什么原因? 如何控制和避免?
【回答】:这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因,使微球表面在交联后还空出许多反应基团时,这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应,结果是把球又拉在一起了,所以有聚集。可以加一些阻断剂解决。
【问题】:胶乳溶液用什么缓冲液多大离子强度保存稳定性更好?
【回答】:一般常用的是低浓度的 Goods 缓冲液,如MOPSO、MES、HEPES 等缓冲液,浓度在25-50mmol/L。

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