免疫比浊项目解决方案

胶乳颗粒增强比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。相对于Elisa方法，省去了孵育和洗板的步骤，几分钟就能获得结果；相对于金标法具有更高的灵敏度，可用于定量检测。

（1）操作简单，可在几分钟内快速、准确地检测含量，真实反映病情进展和评估治疗效果，对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的临床意义；
（2）不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性都很好；
（3）能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用。

因为活性和结合动力学是高度依赖于固定化分子的取向，故可用于偶联和修饰的活性基团必须慎重考虑。

生物分子可通过各种表面化学试剂偶联到聚合物或硅基微球上。可用的表面官能团包括：聚合-羧基和氨基（常用的）以及羟基、肼基和氯甲基；和硅-醇硅基、羧基。

交联剂可用于活跃含水环境中表现出低反应活性的基团（碳二亚胺与羧基结合），或者加入到对彼此没有反应的基团中（如氨基与氨基结合）

微球的特定组成将决定其特性，如如疏水性或亲水性，正电荷或负电荷，表面电荷密度等，这些特点都会对其承载能力有一定影响。也就是说，生物分子怎么有效地进入化学基团附近，以便可能发生偶联。他们还将影响非特异性结合特性，但非特异性结合可能与阻断剂、缓冲液及检测的条件（如：样品稀释）等有关。

试剂的质量对成功的偶联是至关重要的，并影响包被微球的性能。遵从制造商的指引

用于试剂调制，使用，存储，和过期应观察到保证活性和稳定性，并且采取措施防止污染。

确定不同试剂的适当浓度，比如配体或交联剂，对控制表面密度很重要。使用太少会导致包被不是较理想且活性低。使用太多会导致微球“过载”（空间位阻效应，减少活性）或者单纯地浪费昂贵的试剂。

缓冲液的选择和具体方案（配体和反应基团）有关。在选择缓冲液时，考虑到与配体的相容性。此外，还要考虑到缓冲液中不能包含参与或干扰反应的化合物。比如，磷酸盐和醋酸盐缓冲液会降低碳二亚胺的反应活性，因此不建议在羧基微球偶联中作为活跃缓冲液使用。在这种情况下，一种流行的替代是使用MES。又如，在与胺活性化学物质作用时，应避免含有游离胺的缓冲液（Tris或甘氨酸）。

a、磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.4

i. 磷酸氢二钾: 1.82 g/L (MW 174.2)
ii. 磷酸二氢钠: 0.22 g/L (MW 120.0)
iii. 氯化钠: 8.76 g/L (MW 58.4)

用去离子水并定容至1L，用1N盐酸或1N氢氧化钠调节pH至7.4.

b、硼酸盐缓冲液 pH8.5

i. 硼酸, H3BO3: 12.4 g/L (MW 61.8)
ii. 硼氢化钠: 19.1 g/L (MW 381.4)

加入50mL硼酸溶液至14.5mL硼氢化钠溶液中,用去离子水并定容至200mL。用3M的氢氧化钠 调节pH至8.5.

c、醋酸盐缓冲液 pH3.6~5.6

i. 0.1 M 醋酸: (5.8mL制备1000mL)
ii. 0.1 M 醋酸钠: 8.2 g/L (无水, MW 82.0)

按如下所示比例混合醋酸和醋酸钠溶液，用去离子水并定容至100mL。用1N盐酸或 1N氢氧化钠调节pH。

d、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液 pH2.6~7.0

i. 0.1 M 柠檬酸: 19.2 g/L (MW 192.1)
ii. 0.2 M 磷酸氢二钠: 35.6 g/L (二水, MW 178.0)

按如下所示比例混合柠檬酸和磷酸氢二钠溶液，用去离子水并定容至100mL。用1N 盐酸或1N氢氧化钠调节pH。

e、碳酸盐-碳酸氢钠缓冲液 pH9.2-10.4

i. 0.1 M 碳酸钠: 10.6 g/L (无水, MW 106.0)
ii. 0.1 M 碳酸氢钠: 8.4 g/L (MW 84.0)

按如下所示比例混合碳酸钠和碳酸氢钠溶液，用去离子水并定容至200mL。用1N 盐酸或1N氢氧化钠调节pH。

f、MES缓冲液 pH5.7~7.2

溶解21.3gMES一水物至约900mL的纯水中。用1N盐酸或1N氢氧化钠滴定至所需的pH并用纯水定容至1000mL。

*胶乳溶液一般常用低浓度的Good's缓冲液储存。

低浓度(0.05%-0.1%)的抗菌剂,例如叠氮钠或硫柳汞，经常被加入到储存缓冲液中，特别是长期储存的时候。抗菌剂的选择要谨慎，因为他们可能会展现出不同的稳定性，涉及到特殊处理事项等。例如，叠氮钠与铅、铜管道反应会生成易爆的叠氮金属化合物，因此，在清理材料时，要用大量的水冲洗管道并防止叠氮化物积累。

阻断剂通常在偶联反应后用于包被微球，可以使微球与非目标分子的非特异性结合变小。阻断剂应谨慎选择，以确保它可以有效地减少非特异性相互作用。某些阻断剂可能会干扰检测，或实际上有助于非特异性结合。对阻断剂的浓度进行评估，确保有足够的阻挡而没有显著的活性损失。阻断剂通常以不同的量加入到储存缓冲液中，标准浓度为0.05~0.1%中的任意值。在一个独立的孵育中，为了饱和微球的暴露表面，建议在储存前用更高浓度的阻断剂（1%）。以下是一些常用的阻断剂：

a. BSA(牛血清白蛋白）：经常单独使用，但是可以和其他的阻断剂复合使用，常用的表面活性剂。

b. 酪蛋白：一种牛奶基质的蛋白质，含有生物素原，在工作系统涉及生物素时应避免使用以防止干扰。

c. Pepticase（酪蛋白酶解产物）：酪蛋白的酶促衍生物，当工作系统涉及生物素时同样应该避免。

d. 非离子表面活性剂：吐温20和Triton(R)X-100是典型的。当与另一种阻断剂使用时，一个常用的比例为1％阻滞剂; 0.05％的表面活性剂。

e. 不相关的“IgG”：经常在标记特性IgG到微球上时使用。例如：如果偶联小鼠IgG，兔（或任一非交联反应的IgG）可以用作阻断剂被吸附。

f. FSG（鱼皮明胶）：纯明胶或明胶水解产物也可使用。

g. PEG（聚乙二醇）：一个多功能的阻断剂，可提供不同的分子量、结构和负载。

h. 血清：非交联反应血清，如马血清或鱼血清，在与各类抗体的交联反应中都有很强的惰性。

i. 商业阻滞剂：许多公司提供制剂，其是各种分子量的两种或更多种单阻断物质的复合，并且其可以有效地在宽范围的条件下使用。这些以不同的商品名称出售，而大多数化学厂商将提供多种。

阻断剂的品种还有许多，我们建议尝试各种组合和浓度。

微球的处理对偶联过程的结果有着显著的影响。研究人员应该先考虑微球的清洗过程，这会影响偶联的效率，微球的损失等。在过程控制中应当对其的单分散性进行监控，如果观察到凝集则需要处理。

还有其他参数可以被评估，包括培养时间和温度，试剂添加的顺序和速度等。

【问题】：如何选择微球粒径？
【回答】：一般选择粒径小的胶乳微球，则需要的抗体量就多，精密度和线性相对较好，而选择粒径大的胶乳微球性，则所需抗体少，精密度和线性相对较差，相对于小球，大球的灵敏度较好。

【问题】：胶乳的自凝现象如何控制和避免？
【回答】：胶乳自凝与许多因素有关，如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平，使得表面的价负荷被掩蔽，胶乳微球之间发生接触，于是便产生凝集，故高离子强度的缓冲溶液不应使用，缓冲溶液的的浓度不要超过 50mM，但有些 CML 胶乳微球具有高电荷密度，则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球，不能使用阳电荷的缓冲溶液如 Tris 缓冲溶液，因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时，悬浮介质的pH值应至少保持在比胶乳微球表面基团的 pKa 值高1-2pH单位。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不稳定，故胶乳微球的浓度尽量以低浓度为宜，胶乳微球也不能受冷冻，否则会凝集。

【问题】：微球与抗体偶联应选用一步法还是二步法？
【回答】：一步法是将微球、抗体、偶联剂一起加入到体系中进行反应，更适用于小分子的偶联，比如：类固醇、半抗原。

【问题】：微球与抗体偶联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集，这是什么原因？ 如何控制和避免？
【回答】：这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻断剂解决。

【问题】：胶乳溶液用什么缓冲液多大离子强度保存稳定性更好？
【回答】：一般常用的是低浓度的 Goods 缓冲液，如MOPSO、MES、HEPES 等缓冲液，浓度在25-50mmol/L。