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可溶性抗原的制备及鉴定解决方案

发布时间:2021-06-07 点击数:62
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸等均为可溶性抗原,它们有相当部分来源于组织和细胞,成分复杂。制备这类免疫原时,首先须将组织和细胞破碎,然后再从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他抗原,提纯的抗原需鉴定后才能用做免疫原。
组织匀浆的制备
用于制备免疫原的材料必须是新鲜或低温保存的。材料获得后立即去除包膜或结缔组织,脏器应进行灌洗,去除血管内残留的血液,用含0.5g/L NaN3的生理盐水洗去血迹及污物;在4℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成0.3~0.5cm3小块,加入适量生理盐水,装入捣碎机筒内制成组织匀浆。组织匀浆经3000r/min离心10min后,上清液作为提取可溶性抗原的材料。上清液在提取前还必须进行离心去除细胞碎片及微小的组织。
细胞破碎
提取细胞的可溶性抗原,需将细胞破碎。根据细胞类型不同,选择破碎的方法也有一定的差异,现介绍几种常用的细胞破碎方法。
1、酶处理法
溶菌酶、纤维素酶、、蜗牛酶等在一定的条件能消化细菌和组织细胞。如溶菌酶对革兰阳性菌的细胞壁有溶菌作用。酶处理法适用于多种微生物细胞的溶解,该方法具有作用条件温和、内含物成分不易受到破坏、细胞壁损坏程度可以控制等特点。
2、冻融法
细胞主要因突然冷冻,细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度突然改变而破坏。其方法是将破碎的细胞置-15~-20℃冰箱内完全冻结,然后从冰箱取出,让其在30~37℃中缓慢融化。如此反复两次,大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被破。此法适用于组织细胞,对微生物的细胞作用较差。
3、超声破碎法
这是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的一种方法。进行超声破碎时,需间歇进行,避免长时间超声产热,导致抗原破坏。也可将超声粉碎的细胞置于冰浴降温。超声破碎细胞,方法简单,重复性较好,且节省时间。微生物和组织细胞的破碎,均可采用此方法。
4、表面活性剂处理法
在适当的温度、pH及低离子强度的条件下,表面活性剂能与脂蛋白形成微泡,通过细胞膜的通透性改变使细胞溶解。常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠(SDS阳离子型),新洁尔灭,Triton X-100等。此方法作用比较温和。在提取核酸时,常用此法破碎细胞。
蛋白质的提纯
1、超速离心法
用超速离心或梯度密度离心分离和纯化抗原时,除个别成分外,极难将某一抗原成分分离出来,故只用于少数大分子抗原的分离,如IgM、C1q,甲状腺球蛋白等,以及一些比重较轻的抗原物质如载脂蛋白A、B等。多数的中、小分子量蛋白质采用此种方法很难纯化。
2、选择性沉淀法
最常用的方法是盐析沉淀法。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同,不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同,从而使之从其他蛋白分离出来。盐析法简单方便,可用于蛋白质抗原的粗提,丙种球蛋白的提取,蛋白质的浓缩等。盐析法提纯的抗原纯度不高,只适用抗原的初步纯化。
3、凝胶层析法
一种含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶层析柱时,大分子物质不易进入凝胶颗粒的微孔,只能分布于颗粒之间,因此在洗脱时向下移动的速度较快,最先被洗脱。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,洗脱时向下移动的速度较慢,随后被洗脱。因此,蛋白质分子按分子大小被分离。
4、离子交换层析法
离子交换层析的原理是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶,吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。当梯度洗脱时,逐步增加流动相的离子强度,使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置,从而使吸附的蛋白与离子交换剂解离。
5、亲和层析
亲和层析是利用生物大分子的生物特异性,即生物大分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术。当样品流经层析柱时,待分离的IgG可与SPA发生特异性结合,其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后,改变洗脱液的离子强度或pH值,IgG与固相基质上的SPA解离,收集洗脱液便可得到欲纯化的IgG。亲和层析法纯化蛋白质抗原的主要优点是纯度高,简单快捷,但成本较贵。
核酸抗原的制备
核酸分子具有免疫原性,可用于免疫原制备抗体。提取核酸的主要步骤是先将细胞破碎使核酸从细胞中游离出来,再用酚和氯仿抽提以去除蛋白质,最后用乙醇沉淀核酸。
脂多糖抗原的制备
脂多糖(LPS)是革兰氏阳性菌细胞壁的重要成分,有多种生物学效应。通常采用苯酚法提取LPS。
纯化抗原的鉴定
为获得好的免疫效果,抗原纯化后应进行鉴定才能用于动物免疫,抗原的鉴定主要包括以下几个方面:
1、含量检测
蛋白含量的测定最准确的方法是凯氏定氮法,但由于要求有精密设备,故不适合一般实验室。一般实验室均采用分光光度计测量法。该法首先测定280nm和260nm的吸光度(A),再用经验公式计算蛋白含量。
蛋白含量(mg/ml)=A280×1.45-A260×0.74。另外蛋白含量也可采用福林酚法。
2、分子量的鉴定
测定分子量一般采用SDS-PAGE电泳法。
3、纯度鉴定
常采用区带电泳法鉴定。
4、免疫活性鉴定
常采用双向琼脂扩散试验。
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